[發明專利]一種自然共生的混合培養物及其降解秸稈生產香豆酸酯酶的方法

有效

• 申請號: 202011609489.4
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112553127B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 魏亞琴;李偉;王治業
• 申請（專利權）人: 甘肅省科學院生物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/14;C12N9/18;C12R1/01;C12R1/645
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 戴治娟

本發明涉及生物技術可再生能源領域，具體涉及一種自然共生的由厭氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)組成的混合培養物YakQH5，于2020年3月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.19299，所述的混合培養物YakQH5能夠發酵秸稈生產香豆酸酯酶，并具體公開了其發酵方法，其中降解高粱秸稈產生的香豆酸酯酶的活性可達到20.5mU，在發酵過程中添加復合抗生素，可以防止混合培養物體系不受細菌污染，進一步提高厭氧發酵效率，具有重要的工業應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術可再生能源領域，具體為一種自然共生的由厭氧真菌和甲烷菌組成的自然混合培養物及其降解秸稈生產香豆酸酯酶的方法。

背景技術

農作物秸稈是農業廢棄物面源污染的主要來源，且我國的農作物秸稈年產量高，常規的處理方法如露天焚燒、掩埋等，污染環境的同時還會造成大量的能源浪費。然而我國的大量秸稈資源處于高消耗、高污染、低利用率狀況。木質纖維素是秸稈的主要成分，木質纖維素主要由纖維素、半纖維和木質素組成。木質素和半纖維素結合的共價鍵將纖維素分子包埋其中，木質素中醚鍵和碳-碳鍵形成的具有三維結構高分子芳香類化合物，強的共價鍵抑制水解酶的作用，導致木質纖維素的降解很困難。常見的預處理木質纖維素的方法有機械法、熱處理法、化學處理，均能有效的促進木質纖維素的分解，但這些處理方法成本高，不環保。普通的微生物處理也存在較多缺陷，單一微生物處理效果不好，人工構建的復合菌群效果也不理想，各菌種間存在相互拮抗的表現，導致降解木質纖維素的時間長，效率低。

厭氧真菌在木質纖維素的降解中起重要作用。厭氧真菌通過豐富的菌根體系侵襲一些難以被降解的纖維組織，甚至是植物厚壁組織和維管束組織使植物纖維組織變得疏松從而易于被其它瘤胃微生物降解。厭氧真菌中的大多數種屬都能夠通過其假根分泌高活性酶，包括纖維素酶、半纖維素酶(主要是木聚糖酶)和酯酶(包括阿魏酸酯酶、乙酰酯酶和香豆酸酯酶)等多種酶，它們協同作用分解利用結構復雜的，晶體狀的纖維素、半纖維素和果膠等物質。木質纖維素中的木質素和多糖通過酚酸交聯在一起。以酚酸為主的木質素成分是植物細胞壁降解的限制性因素，酚酸中的阿魏酸和香豆酸被認為是細胞壁降解的限制因子。阿魏酸通過酯鍵與多糖相連，通過醚鍵與木質素相連，香豆酸即通過酯鍵也通過醚鍵與木質素相連，厭氧真菌產生的阿魏酸酯酶和香豆酸酯酶能夠打開木質素、阿魏酸、香豆酸和細胞壁多糖交聯的酯鍵結構，減少酯鍵交聯，從而增加木質纖維素的降解。現有研究表明，一些甲烷菌可以利用厭氧真菌的代謝產物，如氫氣、甲烷、甲酸等，與厭氧真菌形成穩定的混合培養物，即：厭氧真菌和甲烷菌混合培養物，這個過程促進了厭氧真菌和甲烷菌的生長，同時顯著提高了厭氧真菌降解木質纖維素所產生的各種木質纖維素降解酶活性和對木質纖維素的降解能力。

牦牛適應高寒生態條件，耐粗飼、耐嚴寒、耐低氧的惡劣自然環境。牦牛瘤胃內棲息著獨特的，復雜多樣，大量的微生物群落協同高效降解野牧草為牦牛提供生存能量和營養物質。漫長的自然選擇和進化使牦牛瘤胃成為一個高效降解木質纖維素的天然厭氧發酵罐。放牧牦牛瘤胃內存在著自然的厭氧真菌和甲烷菌混合培養物，它們能夠分泌高活性的多糖水解酶和酯酶降解大量野生牧草和冷季干枯牧草為牦牛提供生長的營養，因此從牦牛瘤胃分離厭氧真菌和甲烷菌混合培養物并將其應用于降解廉價木質纖維素底物生產高活性酯酶在工業應用方面具有重要意義。發明人在攻讀博士期間首次研究了放牧牦牛瘤胃厭氧真菌和甲烷菌混合培養物分別以小麥秸稈、玉米秸稈和水稻秸稈為底物進行厭氧發酵(魏亞琴.牦牛瘤胃厭氧真菌與甲烷菌混合培養物的多樣性及其纖維降解特性研究[D].2016.)，通過檢測產氣量、多糖水解酶活性、各種酯酶活性、干物質降解率、酚酸釋放量、甲烷和乙酸產量來評估厭氧真菌和甲烷菌共培養物降解秸稈功效，其中高效降解以上三大秸稈的厭氧真菌和甲烷菌共培養物N.frontalis Yak16+M.ruminantium，Piromyces Yak18+M.ruminantium和O.joyonii Yak7+M.ruminantium分別降解三大秸稈所產生的香豆酸酯酶活性都低于5.0mU，不能達到產生高酶活香豆酸酯酶的效果。