[發(fā)明專利]通過基因編輯得到的與不結(jié)球白菜自交親和性狀相關的等位基因及其應用

有效

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• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112575004B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 高長斌;汪愛華;張雪麗;宋莉萍;林處發(fā)
• 申請（專利權）人: 武漢市農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C12N15/82;C12Q1/6895;C12Q1/6809;A01H1/02;A01H1/04;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 重慶項乾光宇專利代理事務所(普通合伙) 50244
• 代理人: 高姜

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，尤其涉及通過基因編輯得到的與不結(jié)球白菜自交親和性狀相關的等位基因及其應用。本發(fā)明所提供的等位基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。本發(fā)明還進一步提供了所述等位基因的分子標記，以及所述等位基因、分子標記的應用。通過基因編輯、遠緣雜交、連續(xù)回交和分子標記輔助選擇等技術手段成功獲得了自交親和的不結(jié)球白菜材料。本發(fā)明打破了不結(jié)球白菜的自交不親和性，采用本發(fā)明方法創(chuàng)建的自交親和材料將能極大提高育種效率，降低制種成本。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，尤其涉及通過基因編輯得到的與不結(jié)球白菜自交親和性狀相關的等位基因及其應用。

背景技術

植物的自交不親和性(self-incompatibility,SI)是指雌蕊柱頭能夠識別自身的花粉，使自身的花粉不能萌發(fā)或伸長，導致不能正常授粉或授粉不能正常結(jié)籽的現(xiàn)象。自交不親和性廣泛分布于十字花科蔬菜作物(白菜、甘藍、蘿卜、西蘭花等)中，在遺傳上受S位點復等位基因控制。S位點主要包括兩個關鍵的識別基因：SRK，控制著柱頭的識別特異性；SP11/SCR，控制著花粉的識別特異性。當花粉落到自身的柱頭上時，花粉SP11/SCR蛋白與柱頭SRK蛋白進行識別，引起SRK蛋白的自體磷酸化以及之后的一系列信號傳導途徑，最終表現(xiàn)為柱頭對自花花粉的抑制作用以及異化花粉的識別作用。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是近年來快速發(fā)展的一種基因定點編輯技術，有實驗方法較簡單、價格低廉、實驗周期短等優(yōu)勢，成為了研究植物基因功能的有效方法。在sgRNA的引導下，Cas9蛋白利用兩種內(nèi)切酶活性，在特異性位點進行切割產(chǎn)生了DNA雙鏈斷裂(DSBs)。DNA雙鏈斷裂則會引起DNA鏈發(fā)生非同源末端鏈接(NHEJ)的修復機制，而這種修復機制的錯配率很高，造成了堿基的缺失或者添加，從而實現(xiàn)對目的基因的編輯。基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的原理，可以通過轉(zhuǎn)基因技術手段實現(xiàn)目標基因的定點編輯，創(chuàng)建新的等位基因，在植物分子育種中具有廣闊的應用前景。前人通過對油菜品系‘Westar’進行研究，發(fā)現(xiàn)其A基因組上的柱頭識別基因BnSRK1具有完整的功能，能識別來自白菜花粉中的BrSP11-47基因，導致自交不親和反應發(fā)生。由于自交不親和性的影響，不結(jié)球白菜的自交結(jié)實率很低，嚴重影響育種材料的繁殖和種子生產(chǎn)。因此，打破不結(jié)球白菜的自交不親和性，創(chuàng)建自交親和的材料將能極大提高育種效率，降低制種成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種與不結(jié)球白菜自交親和性狀相關的基因，該基因能使不結(jié)球白菜表現(xiàn)為自交親和的性狀。

本發(fā)明的技術方案是通過基因編輯得到的與不結(jié)球白菜自交親和性狀相關的等位基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。

本發(fā)明還提供了核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的等位基因的分子標記，其引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示。

本發(fā)明還提供了所述的通過基因編輯得到的與不結(jié)球白菜自交親和性狀相關的等位基因在不結(jié)球白菜育種中的應用。

本發(fā)明還提供了所述的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的等位基因的分子標記在不結(jié)球白菜育種中的應用。

本發(fā)明還提供了所述與不結(jié)球白菜自交親和性狀相關的等位基因的獲得方法，包括如下步驟：根據(jù)BnSRK1基因的結(jié)構信息，在其外顯子1區(qū)域設計2個靶位點，對靶位點片段進行PCR擴增，將擴增片段與基因編輯表達載體進行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得陽性克隆；通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化甘藍型油菜品系‘Westar’下胚軸，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，擴增靶位點，擴增產(chǎn)物進行測序分析，靶位點序列發(fā)生突變的植株中的BnSRK1即為基因編輯得到的等位基因。