[發(fā)明專利]一種高效構(gòu)建細胞文庫的電擊轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011601166.0
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN113122578A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金鳴;袁鵬飛;劉娜;蘇美華
• 申請（專利權(quán)）人: 博雅緝因（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/864;C12N15/87;C12N15/55;C40B50/06
• 代理公司: 北京彩和律師事務(wù)所 11688
• 代理人: 張紅春

本發(fā)明涉及一種高效構(gòu)建細胞文庫的電擊轉(zhuǎn)化方法，所述方法包括：構(gòu)建sgRNA表達細胞；將Cas9mRNA加入到所述sgRNA表達細胞中，進行電擊轉(zhuǎn)化反應(yīng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法通過改變構(gòu)建細胞文庫的方法及技術(shù)路線，最終形成一套能夠快速高效構(gòu)建細胞文庫的方法，能夠不受限于細胞起始量的限制，且能夠顯著縮短sgRNA細胞文庫的構(gòu)建時間，從而有效縮減人工成本和時間成本，并有效拓展細胞文庫構(gòu)建方法的適用范圍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)，更具體的涉及一種高效構(gòu)建細胞文庫的電擊轉(zhuǎn)化方法

背景技術(shù)

基因編輯技術(shù)能夠讓人類對目標基因進行定點“編輯”，從而實現(xiàn)對生物體基因組特定DNA片段的修飾。CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種獲得性免疫系統(tǒng)，運用重復(fù)間隔序列轉(zhuǎn)錄所得的向?qū)NA(gRNAs)有助于Cas蛋白識別并切割外源致病RNA。CRISPR-Cas9系統(tǒng)是目前在真核生物中使用較為廣泛的基因編輯工具，能夠準確高效的實現(xiàn)對靶向基因的編輯。與此同時，CRISPR-Cas9系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于高通量藥物靶點的篩選中。在高通量篩選應(yīng)用中，針對多個靶向基因設(shè)計導(dǎo)向RNA序列(sgRNAs)，運用酶切連接的方式將其插入表達載體后，形成sgRNAs質(zhì)粒文庫。該文庫經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式成功整合到表達有Cas9的宿主細胞后，即可在宿主細胞內(nèi)進行基因編輯，從而形成靶向基因功能缺失的細胞文庫，可用于后續(xù)的藥物靶點篩選。在該過程中，快速高效的構(gòu)建可同時高效表達Cas9蛋白和sgRNAs的細胞文庫以確保細胞編輯效率對于高通量篩選至關(guān)重要。

目前通常采用慢病毒侵染的方式構(gòu)建Cas9蛋白/sgRNAs細胞文庫，首先用慢病毒侵染的方式構(gòu)建Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，待Cas9蛋白在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達后，篩選Cas9表達量較高且表達量均一的細胞進行大量擴增。待細胞數(shù)目擴增到足夠量時，再運用慢病毒侵染的方式將sgRNAs導(dǎo)入Cas9穩(wěn)定表達的細胞中，隨著sgRNAs在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)細胞文庫的編輯。該方法可將Cas9/sgRNAs表達/轉(zhuǎn)錄元件隨機插入宿主細胞基因組中，實現(xiàn)Cas9蛋白/sgRNAs的穩(wěn)定表達/轉(zhuǎn)錄。但該方法構(gòu)建細胞文庫所需的細胞起始量大，細胞擴增所需時間長，不適用于原代細胞以及干細胞等細胞模型。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中構(gòu)建細胞文庫所需的細胞起始量大，細胞擴增所需時間長等問題。本發(fā)明提供了一種高效構(gòu)建細胞文庫的電擊轉(zhuǎn)化方法。

本發(fā)明涉及：

1、一種高效構(gòu)建細胞文庫的方法，包括：

1)構(gòu)建sgRNA表達細胞；和

2)將Cas9 mRNA通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入所述sgRNA表達細胞中。

2、根據(jù)項1所述的方法，其中步驟1)中，通過病毒侵染方式構(gòu)建sgRNA表達細胞。

3.根據(jù)項2所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染復(fù)數(shù)不超過0.3。

4.根據(jù)項3所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染復(fù)數(shù)為0.1-0.3。

5.根據(jù)項1-4任一項所述的方法，其中所述病毒為AVV或慢病毒。

6、根據(jù)項1-5任一項所述的方法，其中所述Cas9 mRNA與所述sgRNA表達細胞的比值為約1X10⁶-1X10⁷個細胞每1μg-120μg Cas9 mRNA，優(yōu)選為約1X10⁶-1X10⁷個細胞每2μg-100μg Cas9 mRNA。

7、根據(jù)項1-6任一項所述的方法，其中當所述電擊轉(zhuǎn)化的細胞數(shù)為約1X10⁶時，所述電擊轉(zhuǎn)化的電壓為200-400V，時長為1ms，脈沖數(shù)為1個。