[發(fā)明專利]一種抗原抗體共展示方法用于膜抗原的抗體文庫篩選

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011601072.3
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112813505A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設計）人: 李京敬;張蔭杰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C40B30/04
• 分類號: C40B30/04;C12N15/12;C12N15/13;C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種針對膜抗原的抗體文庫篩選方法，所述方法包括以下步驟：

(1)構建抗原模塊表達載體，所述抗原模塊表達載體為酵母表達載體，所述抗原模塊表達載體中含有抗原模塊編碼基因，所述抗原模塊編碼基因包括目標抗原編碼基因序列和第一胞內(nèi)效應蛋白結構域編碼基因序列的融合序列，所述目標抗原為膜抗原；

(2)構建抗體模塊表達載體，所述抗體模塊表達載體為酵母表達載體，所述抗體模塊表達載體中含有抗體模塊編碼基因，所述抗體模塊編碼基因包括針對目標抗原的抗體編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應蛋白結構域編碼基因序列的融合序列，所述第二胞內(nèi)效應蛋白結構域適于與所述第一蛋白效應蛋白結構域結合形成效應蛋白；

(3)將步驟(1)獲得的抗原模塊表達載體和步驟(2)獲得的抗體模塊表達載體分別轉(zhuǎn)入宿主菌進行雜交，根據(jù)所述效應蛋白產(chǎn)生的理化效應篩選陽性克隆，獲得抗原特異性抗體文庫。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下技術特征中任一種或幾種：

a)所述跨膜肽選自酵母菌蛋白ALG5(2～25aa)、酵母菌蛋白PHO90(533～565aa)或小鼠CXCR5(162～194aa)蛋白中任一；

b)所述效應蛋白選自連接有報告基因轉(zhuǎn)錄因子的泛素蛋白、熒光蛋白或螢光素酶；優(yōu)選的，所述報告基因轉(zhuǎn)錄因子為GAL4；

c)所述抗體編碼基因序列表達的抗體位于跨膜肽的C端；

d)步驟(3)中，所述宿主菌選自Y187細胞株或AH109菌株中任一；

e)步驟(3)中，所述宿主菌為酵母，優(yōu)選的，所述抗原模塊表達載體和抗體模塊表達載體分別轉(zhuǎn)入不同結合型酵母；

f)所述抗原模塊編碼基因還包括信號肽編碼基因，所述信號肽編碼基因與目標抗原編碼基因連接。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一胞內(nèi)效應蛋白結構域選自熒光蛋白C端或N端結構域、泛素蛋白C端或N端結構域、或螢光素酶N端或C端結構域中任一，所述第二胞內(nèi)效應蛋白結構域包括適于與所述第一胞內(nèi)效應蛋白結合形成熒光蛋白、泛素蛋白或螢光素酶的結構域；優(yōu)選地，第一胞內(nèi)效應蛋白結構域選自泛素蛋白C端或N端結構域，所述第一或第二胞內(nèi)效應蛋白結構域末端連接轉(zhuǎn)錄因子GAL4，更優(yōu)選地，所述泛素蛋白N端結構域氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原模塊編碼基因中，目標抗原編碼基因序列和第一胞內(nèi)效應蛋白結構域編碼基因序列之間通過連接肽連接；所述抗體模塊編碼基因中，抗體編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應蛋白結構域編碼基因序列之間依次通過連接肽連接。

5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，當所述抗體編碼基因表達產(chǎn)物為Fab形式時，所述抗體模塊表達載體包括：

a)輕鏈模塊表達載體：所述輕鏈表達載體包括輕鏈編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應蛋白結構域編碼基因序列的融合序列；

b)重鏈模塊表達載體：所述重鏈表達載體包括重鏈編碼基因序列和恒定區(qū)1區(qū)序列的融合序列；

步驟3)包括：將轉(zhuǎn)化有抗原及抗體重鏈表達模塊的第一酵母菌株A，與轉(zhuǎn)化有輕鏈模塊表達載體的第二酵母菌株B雜交。

6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，當所述抗體編碼基因表達產(chǎn)物為scFv形式時，所述抗體模塊表達載體包括：

抗體模塊編碼基因，所述抗體模塊編碼基因是針對目標抗原的抗體編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應蛋白結構域編碼基因序列的融合序列。