[發(fā)明專利]一種抗原抗體共展示方法用于膜抗原的抗體文庫篩選

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011601072.3
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112813505A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李京敬;張蔭杰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C40B30/04
• 分類號: C40B30/04;C12N15/12;C12N15/13;C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種針對膜抗原的抗體文庫篩選方法，所述方法包括以下步驟：

(1)構(gòu)建抗原模塊表達(dá)載體，所述抗原模塊表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體，所述抗原模塊表達(dá)載體中含有抗原模塊編碼基因，所述抗原模塊編碼基因包括目標(biāo)抗原編碼基因序列和第一胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域編碼基因序列的融合序列，所述目標(biāo)抗原為膜抗原；

(2)構(gòu)建抗體模塊表達(dá)載體，所述抗體模塊表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體，所述抗體模塊表達(dá)載體中含有抗體模塊編碼基因，所述抗體模塊編碼基因包括針對目標(biāo)抗原的抗體編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域編碼基因序列的融合序列，所述第二胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域適于與所述第一蛋白效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成效應(yīng)蛋白；

(3)將步驟(1)獲得的抗原模塊表達(dá)載體和步驟(2)獲得的抗體模塊表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入宿主菌進(jìn)行雜交，根據(jù)所述效應(yīng)蛋白產(chǎn)生的理化效應(yīng)篩選陽性克隆，獲得抗原特異性抗體文庫。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下技術(shù)特征中任一種或幾種：

a)所述跨膜肽選自酵母菌蛋白ALG5(2～25aa)、酵母菌蛋白PHO90(533～565aa)或小鼠CXCR5(162～194aa)蛋白中任一；

b)所述效應(yīng)蛋白選自連接有報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄因子的泛素蛋白、熒光蛋白或螢光素酶；優(yōu)選的，所述報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄因子為GAL4；

c)所述抗體編碼基因序列表達(dá)的抗體位于跨膜肽的C端；

d)步驟(3)中，所述宿主菌選自Y187細(xì)胞株或AH109菌株中任一；

e)步驟(3)中，所述宿主菌為酵母，優(yōu)選的，所述抗原模塊表達(dá)載體和抗體模塊表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入不同結(jié)合型酵母；

f)所述抗原模塊編碼基因還包括信號肽編碼基因，所述信號肽編碼基因與目標(biāo)抗原編碼基因連接。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域選自熒光蛋白C端或N端結(jié)構(gòu)域、泛素蛋白C端或N端結(jié)構(gòu)域、或螢光素酶N端或C端結(jié)構(gòu)域中任一，所述第二胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域包括適于與所述第一胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)合形成熒光蛋白、泛素蛋白或螢光素酶的結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，第一胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域選自泛素蛋白C端或N端結(jié)構(gòu)域，所述第一或第二胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域末端連接轉(zhuǎn)錄因子GAL4，更優(yōu)選地，所述泛素蛋白N端結(jié)構(gòu)域氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原模塊編碼基因中，目標(biāo)抗原編碼基因序列和第一胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域編碼基因序列之間通過連接肽連接；所述抗體模塊編碼基因中，抗體編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域編碼基因序列之間依次通過連接肽連接。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述抗體編碼基因表達(dá)產(chǎn)物為Fab形式時(shí)，所述抗體模塊表達(dá)載體包括：

a)輕鏈模塊表達(dá)載體：所述輕鏈表達(dá)載體包括輕鏈編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域編碼基因序列的融合序列；

b)重鏈模塊表達(dá)載體：所述重鏈表達(dá)載體包括重鏈編碼基因序列和恒定區(qū)1區(qū)序列的融合序列；

步驟3)包括：將轉(zhuǎn)化有抗原及抗體重鏈表達(dá)模塊的第一酵母菌株A，與轉(zhuǎn)化有輕鏈模塊表達(dá)載體的第二酵母菌株B雜交。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述抗體編碼基因表達(dá)產(chǎn)物為scFv形式時(shí)，所述抗體模塊表達(dá)載體包括：

抗體模塊編碼基因，所述抗體模塊編碼基因是針對目標(biāo)抗原的抗體編碼基因序列、跨膜肽編碼基因序列、以及第二胞內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域編碼基因序列的融合序列。