[發明專利]一種抗原抗體共展示方法用于膜抗原的抗體文庫篩選

在審

• 申請號: 202011601072.3
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112813505A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 李京敬;張蔭杰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C40B30/04
• 分類號: C40B30/04;C12N15/12;C12N15/13;C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發明公開了一種抗原抗體共展示方法用于膜抗原的抗體文庫篩選。本發明所要針對目標抗原為膜蛋白，將目標抗原表達在細胞膜上，并將該目標抗原與細胞膜內側的效應蛋白結構域偶聯。同時將針對目標抗原的特異性抗體文庫通過跨膜肽表達在細胞膜表面，并且通過跨膜肽與胞內效應蛋白結構域偶聯。如果細胞表面抗體和抗原雙方能夠發生作用，與雙方所融合表達的效應蛋白結構域會重新組裝成為有功能的效應蛋白，通過轉錄報告基因報告所述抗體與抗原的成功結合。采用本發明的技術方案可以快速有效的篩選出針對目標抗原的特異性抗體。

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域，特別是涉及一種抗原抗體共展示方法用于膜抗原的抗體文庫篩選。

背景技術

多次跨膜蛋白(multi-pass membrane proteins,MMPs)是一類重要的膜蛋白質受體，主要包括了G蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptors，GPCRs)和離子通道蛋白(Ion channel proteins)，前者為7次跨膜蛋白，介導胞外信號向胞內轉導；后者為跨膜次數不確定的筒狀膜蛋白，介導細胞內外離子交換。MMPs在生命活動中起到重要的作用，所以成為一類重要的藥物靶點。早期通過小分子藥物對MMPs功能進行干預，但是由于許多MMPs，尤其是GPCR家族蛋白具有極高的序列同源性和結構的保守性，因此大部分小分子藥物對MMPs選擇性不強，會出現許多不確定的交叉反應，導致副作用明顯。

單克隆抗體因為良好的靶點特異性和長效性成為一種優秀的靶向藥物。隨著生物技術的發展，有目的單克隆抗體藥物開發成為了可能，很快成為藥物開發的熱點。但針對MMPs的單克隆抗體藥物開發仍然困難重重。根據2019年上市抗體藥物統計，僅有2種GPCR的靶向抗體藥物上市，其余抗體藥物的靶點均為單跨膜蛋白或粘附分子，這說明MMPs單抗的開發難度很大。

目前，MMPs單抗藥物開發的最大的困難是如何取得天然結構的抗原。目前最常用的抗體篩選技術為雜交瘤技術和噬菌體展示技術，兩者都需要純化的、具有天然構象的目標蛋白作為基礎，或作為免疫原用于免疫動物(雜交瘤技術)，或作為抗原對文庫進行淘洗(噬菌體展示技術)。而MMPs恰恰是一種極難純化的蛋白質，因為MMPs依賴細胞質膜維持天然結構，現有的純化技術難以在不將MMPs從磷脂雙分子層上剝離(去垢劑法)的情況下對其進行純化，而一旦MMPs從脂雙分子層上剝離，就會導致構象嚴重改變。

一些方法使用人工磷脂分子恢復MMPs的天然結構，但是收效甚微。另一些方法通過單獨表達MMPs的胞外結構作為抗原，但仍然無法保證抗原的結構。還有方法繞過蛋白純化步驟，直接將表達有MMPs的載體細胞用于免疫動物，避免了對MMPs天然構象的破壞。但是這種方法常常無法成功，可能因為免疫失敗的原因包括靶蛋白豐度低、無免疫佐劑、種屬間序列同源導致免疫耐受等問題。也有文獻報，通過將靶基因直接轉染到動物體內表達，產生免疫應答，制備雜交瘤。這些方法雖然克服了抗原構象問題，但是這些載體中表達的膜蛋白不能引起充分的免疫反應，在實際應用中鮮有成功的報道。同理，沒有天然構象的MMPs分子作為抗原，各種抗體展示技術(包括噬菌體展示、酵母展示、哺乳動物細胞展示、昆蟲病毒展示等)均無法對文庫進行淘洗，也就無法進行有效篩選。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種抗原抗體共展示方法用于膜抗原的抗體文庫篩選，用于篩選針對膜蛋白的抗體，例如單克隆抗體。

本發明所要針對的目標抗原為膜蛋白，可將目標抗原表達在細胞膜上，將該目標抗原與細胞內側的效應蛋白結構域偶聯。同時將抗體文庫(如單鏈抗體文庫或Fab文庫)通過跨膜肽表達在細胞膜表面，并且通過跨膜肽與胞內效應蛋白結構域偶聯。如果細胞表面抗體和抗原雙方能夠發生作用，與雙方所融合表達的效應蛋白結構域會重新組裝成為有功能的效應蛋白，通過轉錄報告基因報告所述抗體與抗原的成功結合。采用本發明的技術方案可以快速有效的篩選出針對目標抗原的特異性抗體。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種針對膜抗原的抗體文庫篩選方法，所述方法包括以下步驟：