[發明專利]一種腈水合活性專一性提高的腈水解酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202011598638.1
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112626056B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 鄭仁朝;聞鵬飛;湯曉玲;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種腈水合活性專一性提高的腈水解酶突變體及其應用，所述突變體是將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位、第136位、第224位、第226位進行單突變或多突變獲得的。本發明構建的突變體R224S/V226R/I136Q/A87M催化苯乙腈時，反應主產物為苯乙酰胺，酰胺的含量達到91.2％，腈水合活力為OsNIT的113.3％。野生型腈水解酶OsNIT催化苯乙腈時，苯乙酰胺含量為50.6％，同時將OsNIT腈水合活力記為100％。R224S/V226R/I136Q/A87M酰胺含量和水合活力分別為野生型的1.53倍和1.13倍。對腈水解酶的反應專一性調控使其能夠應用于酰胺綠色工業催化合成，具有重要意義。

(一)技術領域

本發明涉及一種腈水合活性專一性提高的腈水解酶突變體及其在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的應用。

(二)背景技術

腈化合物是一類含氰基的有機化工原料，廣泛用于化工、醫藥、農藥和材料工業。腈水解酶能夠催化腈化合物水解生成羧酸，具有獨特的化學選擇性、立體選擇性和區域選擇性等優勢，在腈化合物轉化中發揮重要作用。一些腈水解酶除催化腈化合物水解生成羧酸外，同時具有腈水合活性。如Piotrowski等發現擬南芥腈水解酶同時具有腈水解和腈水合活性，能夠催化β-氰基-L-丙氨酸轉化為天冬酰胺和天冬氨酸，天冬酰胺的含量高達60％以上(J.Biol.Chem.,2001,276,2616-2621)。此外，Bradyrhizobiumjaponicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高達33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113-118)。

腈水解酶同時具有腈水解和水合活力的特性使其在生物有機合成中具有巨大潛力。提高腈水解酶的水合活性，可創制新型“腈水合酶”，開辟高效合成β-氨(羥)基酰胺的全新途徑。因此，腈水解酶反應專一性的調控對開發腈水解酶生物催化新功能具有重要意義。

隨著基因工程技術的迅猛發展，通過分子改造可顯著提高腈水解酶的活性、穩定性及底物特異性等催化性能。近年來，腈水解酶反應專一性的調控也成為研究熱點。Pseudomonas fluorescensEBC191腈水解酶突變體C163Q明顯提高了催化產物中酰胺的比例，并且降低了對(R)-扁桃腈的水解活力(Appl.Environ.Microbiol.,2010,76,3668-3674)。姜水琴等改造Synechocystissp.PCC6803腈水解酶，獲得了酰胺比例達73％的突變體F193N，其酰胺合成能力達野生型的35倍，但催化活力為野生型的50％(Catal.Sci.Technol.,2017,7,1122-1128)。張焱等改造水稻(Oryza sativa)腈水解酶OsNIT，突變體Y77E/R224S/V226R以苯乙腈為底物時，酰胺含量達到94.8％(CN111321132A)。進一步研究發現，Y77E/R224S/V226R水合活性僅為野生型的74.35％。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種腈水合活性專一性提高的腈水解酶突變體、編輯基因、工程菌及在合成苯乙酰胺中的應用，對OsNIT進行合成酰胺方向(提高產物中酰胺含量)反應專一性調控，在保持水合活力的同時，提高酰胺含量，降低羧酸含量。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種腈水合活性專一性提高的腈水解酶突變體，所述突變體是將SEQID NO.1所示氨基酸序列第87位、第136位、第224位、第226位進行單突變或多突變獲得的。所述突變體可采用易錯PCR、定點飽和突變及組合突變構建獲得。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。