[發明專利]一種腈水合活性專一性提高的腈水解酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202011598638.1
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112626056B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 鄭仁朝;聞鵬飛;湯曉玲;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種腈水合活性專一性提高的腈水解酶突變體，其特征在于所述突變體為下列之一：(1)將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位丙氨酸突變為蛋氨酸；(2)將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位丙氨酸突變為蛋氨酸，第136位異亮氨酸突變為谷氨酰胺，第224位精氨酸突變為色氨酸且第226位纈氨酸突變為精氨酸。

2.一種權利要求1所述腈水解酶突變體的編碼基因。

3.一種權利要求2所述編碼基因構建的重組基因工程菌。

4.一種權利要求1所述腈水解酶突變體在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的應用。

5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述的應用為：以含腈水解酶突變體編碼基因的工程菌經發酵培養后獲得的濕菌體或濕菌體破碎后提取的酶作為生物催化劑，以苯乙腈為底物，以甲醇為助劑，以pH為7.5～8.5的緩沖液為反應介質構成轉化體系，在30～60℃、150～500rpm/min條件下進行轉化反應，反應結束后取反應液分離純化，獲得苯乙酰胺。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于轉化體系中底物的加入終濃度以緩沖液體積計為20-100mM，催化劑的用量以濕菌體重量計，所述濕菌體加入量以緩沖液體積計為5-20g/L；所述甲醇體積加入量為緩沖液體積的2-8％。

7.如權利要求5所述的應用，其特征在于緩沖液為pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液。

8.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述濕菌體的制備方法為：含腈水解酶突變體編碼基因的工程菌接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、200rpm條件下振蕩培養8-10h，獲得種子液；將種子液以體積濃度2％的接種量接種至新鮮的含有終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、180rpm條件下振蕩培養至菌體OD₆₀₀為0.6-0.8，加入終濃度0.1mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃、180rpm條件下誘導培養10-12h，于4℃、8000rpm離心10min，收集菌體細胞，即為濕菌體。