[發明專利]一種實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202011593439.1
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN112680547B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 何宗順;曲峰
• 申請（專利權）人: 蘇州白堊紀生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京格允知識產權代理有限公司 11609
• 代理人: 譚輝

本發明提供了一種實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒及其應用。所述試劑盒包括：(i)擴增反應試劑；(ii)混合酶試劑；和(iii)擴增檢測試劑。本發明還提供所述實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒與病毒樣本滅活裂解試劑盒以及靶核酸磁性捕獲試劑或試劑盒結合來實現病毒滅活、捕獲和實時熒光恒溫擴增檢測中的應用本發明的滅活裂解試劑盒可以在室溫快速滅活又減少RNA的降解，靈敏度高；靶核酸磁性捕獲試劑的特異性更強，所得模板的質量好且數量多；實時熒光核酸恒溫擴增技術將逆轉錄和擴增在一起進行，縮短了反應的時間，提供了檢測試劑的靈敏度。

本申請是申請號為“2020101751855”、發明名稱為“一種病毒滅活、捕獲和實時熒光恒溫擴增檢測試劑盒及其應用”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及病毒的生物檢測技術領域，具體涉及一種病毒滅活試劑盒、病毒核酸捕獲試劑盒、實時熒光恒溫擴增檢測試劑盒及其應用，尤其是涉及將采集滅活裂解一體化、特異性靶標磁性捕獲和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術結合在一起的病毒特別是2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)前處理及檢測相關試劑盒及其應用。

背景技術

2020年的春節，突如其來的新型冠狀病毒肺炎疫情持續蔓延，當前形勢仍然嚴峻。新型冠狀病毒(2019?Novel?Coronavirus,2019-nCoV)是一種RNA病毒，它的遺傳物質是核糖核酸，其特異性核酸序列是區分這一病毒與其他病原體的標志物。而新型冠狀病毒核酸檢測目的就是為了在感染患者體內找到該病毒的存在。新型冠狀病毒檢測目前普遍采用的是核酸檢測方法包括病毒RNA提取和第二代實時熒光定量PCR技術。病毒RNA提取過程即為前處理過程，其中將標本(咽拭子、口咽拭子、痰液和肺泡灌洗液等)中的病毒RNA純化分離。熒光定量PCR核酸檢測的技術原理是先將新型冠狀病毒RNA逆轉錄為DNA，再將標本中的特定核酸序列進行擴增，理論上進行30次左右的擴增，其核酸數量達就可達到一定的檢測標準，再通過熒光等常規方式進行檢測。

目前，已有多個國家和地區發布2019-nCoV的確診檢測方法。中國疾病預防控制中心推薦檢測的基因靶標為ORF1ab和N基因；香港大學推薦ORF1b-nsp14和N基因；德國查理特推薦RdRP、E和N基因。我國首批獲證有6家企業提供的檢測方法包括核酸提取、逆轉錄和PCR擴增；所需時間為2小時至4小時；其中核酸提取一般需要1-2小時，逆轉錄過程需要1小時，而PCR擴增需要40-90分鐘；最低檢測限為500-1000copies/mL。

2020年2月5日，中國工程院副院長、呼吸與危重癥醫學專家王辰教授提到：“目前的檢測方式主要還是對于病毒核酸的檢測，但新冠病毒有一個特點，并不是所有感染的患者都能測出核酸陽性?！焙怂釞z測對于陽性病人，最高有30～50％的陽性率，也就是說，有些患者核酸檢測結果為陰性，卻在臨床上被確認為疑似新冠肺炎，屬于“假陰性”，一些人因此質疑這項檢測無法發揮作用?！奥z”情況使一些臨床醫生和民眾對檢測試劑盒的質量提出了疑問。

應對上述疑問，重慶人民醫院三院檢驗科對不同的新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑的檢測性能進行比較和分析。收集該院1例弱陽性患者不同時間點采集的咽拭子標本，選取上述6種國產試劑(A-F)平行檢測，進行RNA提取和擴增，根據各試劑檢測結果比較其性能。結果發現，C和F試劑3次平行檢測結果(ORF1ab和N基因)均為陽性，D試劑均未檢出N基因，A、B、E試劑均有未檢出ORF1ab情況存在；C試劑批內重復檢測結果最佳；F試劑(N和ORF1ab)、E試劑(ORF1ab)和A試劑(ORF1ab)3次檢測結果的CT值有趨勢性變化。這些結果表明，6種2019-nCoV核酸檢測試劑對弱陽性樣品的檢測能力有差異，部分試劑的準確性、靈敏度及重復性欠佳，亟需進一步優化，提高其性能，以便更好地適應大規模的篩查需求。