[發明專利]一種實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202011593439.1
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN112680547B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 何宗順;曲峰
• 申請（專利權）人: 蘇州白堊紀生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京格允知識產權代理有限公司 11609
• 代理人: 譚輝

1.一種實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：（i）2×擴增反應緩沖液；（ii）混合酶試劑；和（iii）擴增檢測試劑；

其中，2×擴增反應緩沖液的組成為：10.5mM?Tris-HCl、15.2mM?MgCl₂、0.2%PVP?40、13.5mM?KCl、2.5%甘油、0.05mM醋酸鋅二水合物、各0.725mM?dNTP、各5.56mM?NTP，pH7.0；

所述混合酶試劑的組成為500-1000U?的T7?RNA?聚合酶、1000-2000U逆轉錄酶、15mMHEPES、50mM?N-乙酰基-L-半胱氨酸、1mM?EDTA、0.05%(w/v)疊氮化鈉、1%?TritonX-100、50mM?KCl、20％(v/v)甘油、200mM?海藻糖二水合物，pH7.0；

所述擴增檢測試劑包含Tris、EDTA、用于擴增靶核酸的引物對和探測靶核酸探針；

所述引物對包括基于RNA聚合酶啟動子序列的正向引物和基于非RNA聚合酶啟動子序列的反向引物，所述正向引物包含位于5'末端的RNA?聚合酶啟動子序列和位于3'末端的正向靶核酸結合序列，所述反向引物包含反向靶核酸結合序列；

所述RNA聚合酶啟動子序列為T7?RNA?聚合酶啟動子序列；

所述正向引物包含位于5'末端的T7?RNA?聚合酶啟動子序列和位于3'末端的正向靶核酸結合序列；

所述位于5'末端的T7?RNA?聚合酶啟動子序列為SEQ?ID?NO.?5所示的序列；

所述試劑盒的靶標為ORF1ab基因和N基因，針對ORF1ab基因的反向引物如SEQ?ID?NO.6所示，針對ORF1ab基因的正向引物如SEQ?ID?NO.7所示，針對ORF1ab基因的探針如SEQ?IDNO.?10所示；針對N基因的反向引物如SEQ?ID?NO.8所示，針對N基因的正向引物如SEQ?IDNO.9所示，針對N基因的探針如SEQ?ID?NO.?11所示。

2.根據權利要求1所述的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：

在擴增反應體系為25μL的情況下，所述擴增反應體系包含12.5μL的擴增反應試劑、2.5μL的引物探針混合液和5.0μL混合酶試劑，靶核酸加入量為5μL。

3.根據權利要求1所述的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：

利用所述檢測試劑通過如下方式配制檢測液：將用于擴增靶核酸的引物對和探測靶核酸探針溶解在TE?溶液中配制而成，所述TE?溶液包含10mM?Tris和1mM?EDTA,?pH7.5。

4.根據權利要求1所述的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：各引物和探針濃度在5-10pmol/?反應。

5.根據權利要求1所述的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：

T7啟動子引物的濃度為6.5pmol/?反應，?檢測探針的濃度為5.5pmol/?反應。

6.一種病毒滅活、捕獲和實時熒光恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括；

（1）病毒樣本滅活裂解試劑盒；

（2）靶核酸磁性捕獲試劑或靶核酸捕獲試劑盒；

（3）權利要求1至5中任一項所述的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。

7.根據權利要求6所述的病毒滅活、捕獲和實時熒光恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述靶核酸磁性捕獲試劑包括：

（1）作為固相載體的磁性高分子微球，所述磁性高分子微球包括由γFe₂O₃和Fe₃O₄磁性材料制成的微球體和包被所述微球體的一層或多層多聚材料，并且所述磁性高分子微球的表面修飾有微球連接基團；

（2）中間探針，所述中間探針包括5’修飾非核苷酸單元、3’修飾寡聚核苷酸單元和可選的中間臂，并且所述中間探針通過所述微球連接基團與所述5’修飾非核苷酸單元結合來與所述磁性高分子微球連接；

（3）捕獲探針，所述捕獲探針包括與靶核酸特異性互補的5’特異性序列和3’polyA序列。