[發(fā)明專(zhuān)利]EP402R、CP204L和E183L共表達(dá)重組腺病毒及構(gòu)建和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011592585.2
• 申請(qǐng)日: 2020-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112522286A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃明生;張泉;朱立麒;殷俊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/34
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/34;C12N15/62;C12N15/861;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發(fā)明提供了EP402R、CP204L和E183L共表達(dá)重組腺病毒及構(gòu)建和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，所述基因插入到pShuttle?CMV真核表達(dá)載體上，能夠用于構(gòu)建表達(dá)非洲豬瘟病毒EP402R、CP204L和E183L蛋白的重組腺病毒，該重組腺病毒能夠直接感染真核細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)EP402R、CP204L與E183L基因在真核細(xì)胞中共表達(dá)的目的，為進(jìn)一步研究基于共表達(dá)EP402R、CP204L與E183L基因重組腺病毒載體疫苗打好基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及EP402R、CP204L和E183L共表達(dá)重組腺病毒及構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(african swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swinefevervirus，ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病。其特征為病程短、病死率高、臨床癥狀和病理變化均類(lèi)似于急性豬瘟，表現(xiàn)高熱、皮膚充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血。CD2v是ASFV外膜蛋白中唯一特征性病毒蛋白，由ORF EP402R基因編碼，也稱(chēng)為pEP402R。p30是ASFV表達(dá)的早期膜蛋白，由ORF CP204L基因編碼。P54蛋白是ASFV的I型跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，由E183L基因編碼，在病毒的復(fù)制過(guò)程中起重要作用，參與該病毒對(duì)細(xì)胞的吸附和侵入，能引起宿主細(xì)胞凋亡，在病毒變形和感染早期起重要作用。但是目前還沒(méi)有針對(duì)EP402R、CP204L和E183L的重組腺病毒疫苗以及制備該重組腺病毒疫苗的可行方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供EP402R、CP204L和E183L共表達(dá)重組腺病毒及構(gòu)建和應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種EP402R、CP204L和E183L共表達(dá)的基因，所述基因是將EGFP基因、第一連接基因、EP402R基因、第二連接基因、CP204L基因、第二連接基因和E183L基因順次串聯(lián)得到；所述EP402R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述CP204L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述E183L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述第一連接基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述第二連接基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

本發(fā)明還提供了一種含有上述方案所述基因的重組載體，所述重組載體以pShuttle-CMV載體為原始載體；所述基因的插入位點(diǎn)為KpnI和HindIII之間。

本發(fā)明還提供了一種重組腺病毒載體，插入有上述方案所述重組載體，插入位點(diǎn)為PmeI酶切位點(diǎn)序列的第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)之間；所述第一位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示；所述第二位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。

本發(fā)明還提供了上述方案所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

使用限制性?xún)?nèi)切酶PmeI對(duì)上述方案所述重組載體進(jìn)行酶切，得到線性化質(zhì)粒，將所述線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含pAdEasy-1質(zhì)粒的大腸桿菌中，經(jīng)過(guò)重組獲得重組腺病毒載體。

本發(fā)明還提供了一種包含上述方案所述重組腺病毒載體或者所述構(gòu)建方法得到重組腺病毒載體的重組腺病毒。

本發(fā)明還提供了上述方案所述重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：將所述重組腺病毒載體經(jīng)過(guò)PacI酶切線性化，得到線性化質(zhì)粒，采用所述線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，獲得重組腺病毒。

本發(fā)明還提供了上述方案所述重組腺病毒或所述構(gòu)建方法得到的重組腺病毒在制備非洲豬瘟疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種非洲豬瘟疫苗，包括免疫佐劑和免疫原，其特征在于，所述免疫原為上述方案所述重組腺病毒或所述構(gòu)建方法得到的重組腺病毒。