[發(fā)明專利]一種高效篩選細(xì)菌感染特效藥的細(xì)胞膜色譜柱制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011592318.5
• 申請(qǐng)日: 2020-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN112666299A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊天逸
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通華葉生物科技集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/60
• 分類號(hào): G01N30/60
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種高效篩選細(xì)菌感染特效藥的細(xì)胞膜色譜柱制備方法，其特征在于包括制備全細(xì)胞蛋白提取液、制備APTES共價(jià)修飾后的硅膠、細(xì)胞膜和硅膠鍵合及濕法裝柱四個(gè)步驟；所述全細(xì)胞蛋白提取液制備中，采用變性裂解液以及非變性裂解液作為試劑，采用離心機(jī)、1.5ml離心試管和中部具有一道隔膜的50ml柱形聚乙烯離心試管作用提取工具，經(jīng)以下幾個(gè)步驟制得，第一步：把細(xì)胞放于1.5ml離心試管中，并加入1ml的PBS細(xì)胞洗滌溶液，然后用離心機(jī)離心3分鐘，棄除上清，離心、棄除上清流程共重復(fù)三次，第二步，根據(jù)細(xì)胞沉淀體積加入預(yù)冷的PBS細(xì)胞洗滌溶液，進(jìn)行細(xì)胞重懸，第三步，根據(jù)離心試管內(nèi)細(xì)胞量加入變性裂解液，震蕩15s，第四步，將震蕩后裂解液轉(zhuǎn)移于50ml柱形聚乙烯離心試管內(nèi)，離心機(jī)離心30s后，收集管底的裂解液即為全細(xì)胞蛋白提取液；所述制備APTES共價(jià)修飾后的硅膠中，用有特定蛋白高表達(dá)的細(xì)胞制備細(xì)胞膜層析柱，加入其抑制劑，使用ph7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌，以去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，隨后采用ph3.3的磷酸鹽緩沖液洗脫緩沖液，收集洗脫液，經(jīng)濃縮后，高效液相檢測(cè)；所述細(xì)胞膜和硅膠鍵合中，在真空渦旋的條件下，將細(xì)胞膜懸液和硅膠常溫下混合反應(yīng)5 rain，然后冰浴條件下攪拌50 rain，得到的細(xì)胞膜．硅膠混懸液，置于4℃冰箱中靜置過(guò)夜；所述濕法裝柱中，采用Waters996．515型液相泵，以PBS緩沖液為流動(dòng)相將細(xì)胞膜．硅膠混懸液裝填到細(xì)胞膜色譜柱芯中，梯度升速，0．5 min：0．2—1．0 mL／min，然后在O．2 mL／min流速下平衡30 rain，從而得到穩(wěn)定的柱壓；細(xì)胞膜色譜柱浸泡在PBS緩沖液中，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效篩選細(xì)菌感染特效藥的細(xì)胞膜色譜柱制備方法，其特征在于，制備APTES共價(jià)修飾后的硅膠中，硅膠表面含有豐富的硅羥基(Si—OH)，先和(3．氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反應(yīng)后鏈接上了氨基，然后和戊二醛反應(yīng)，鏈接上一個(gè)醛基；細(xì)胞膜是由豐富的磷脂構(gòu)成的，因此含有大量氨基；鍵合了醛基的硅膠和細(xì)胞膜上氨基發(fā)生氨醛縮合反應(yīng)，從而使硅膠和細(xì)胞膜以共價(jià)的方式結(jié)合。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效篩選細(xì)菌感染特效藥的細(xì)胞膜色譜柱制備方法，其特征在于，制備APTES共價(jià)修飾后的硅膠中，分為如下步驟，（1）精確稱取1 g硅膠粉末，量取0．5 mLAPTES一起加入到50 mL甲苯體系中，在N2 保護(hù)下，油浴鍋中恒溫加熱回流反應(yīng)12h；（2）將混懸液收集并在12009×5 min室溫條件下離心，棄上清，留沉淀；沉淀用HEPES 緩沖液(100 mM)清洗3次后80℃恒溫烘干，得干燥粉末；（3）干燥粉末加入500 mL 5％戊二醛甲醇溶液常溫?cái)嚢? h，此時(shí)溶液由白色變成磚紅色；在1200Gx 5 min室溫條件下離心，棄上清，留沉淀；沉淀用HEPES緩沖液清洗3次；（4）沉淀加入500 mL磷酸鈉溶液(100 mM，pH=8)常溫?cái)嚢? h，使反應(yīng)后的基團(tuán)展開，混懸液在12009×5 min室溫條件下離心，棄上清，留沉淀。

4.沉淀用HEPES緩沖液清洗3次；（5）沉淀在80℃恒溫條件下烘干，得干燥磚紅色粉末即為APTES共價(jià)修飾后的硅膠。