[發明專利]一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法

在審

• 申請號: 202011592318.5
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112666299A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 楊天逸
• 申請（專利權）人: 南通華葉生物科技集團有限公司
• 主分類號: G01N30/60
• 分類號: G01N30/60
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法，其特征在于包括制備全細胞蛋白提取液、制備APTES共價修飾后的硅膠、細胞膜和硅膠鍵合及濕法裝柱四個步驟；所述全細胞蛋白提取液制備中，采用變性裂解液以及非變性裂解液作為試劑，采用離心機、1.5ml離心試管和中部具有一道隔膜的50ml柱形聚乙烯離心試管作用提取工具，經以下幾個步驟制得，第一步：把細胞放于1.5ml離心試管中，并加入1ml的PBS細胞洗滌溶液，然后用離心機離心3分鐘，棄除上清，離心、棄除上清流程共重復三次，第二步，根據細胞沉淀體積加入預冷的PBS細胞洗滌溶液，進行細胞重懸，第三步，根據離心試管內細胞量加入變性裂解液，震蕩15s，第四步，將震蕩后裂解液轉移于50ml柱形聚乙烯離心試管內，離心機離心30s后，收集管底的裂解液即為全細胞蛋白提取液；所述制備APTES共價修飾后的硅膠中，用有特定蛋白高表達的細胞制備細胞膜層析柱，加入其抑制劑，使用ph7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌，以去除非特異性結合的雜質，隨后采用ph3.3的磷酸鹽緩沖液洗脫緩沖液，收集洗脫液，經濃縮后，高效液相檢測；所述細胞膜和硅膠鍵合中，在真空渦旋的條件下，將細胞膜懸液和硅膠常溫下混合反應5 rain，然后冰浴條件下攪拌50 rain，得到的細胞膜．硅膠混懸液，置于4℃冰箱中靜置過夜；所述濕法裝柱中，采用Waters996．515型液相泵，以PBS緩沖液為流動相將細胞膜．硅膠混懸液裝填到細胞膜色譜柱芯中，梯度升速，0．5 min：0．2—1．0 mL／min，然后在O．2 mL／min流速下平衡30 rain，從而得到穩定的柱壓；細胞膜色譜柱浸泡在PBS緩沖液中，4℃條件下保存備用。

2.根據權利要求1所述的一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法，其特征在于，制備APTES共價修飾后的硅膠中，硅膠表面含有豐富的硅羥基(Si—OH)，先和(3．氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反應后鏈接上了氨基，然后和戊二醛反應，鏈接上一個醛基；細胞膜是由豐富的磷脂構成的，因此含有大量氨基；鍵合了醛基的硅膠和細胞膜上氨基發生氨醛縮合反應，從而使硅膠和細胞膜以共價的方式結合。

3.根據權利要求1所述的一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法，其特征在于，制備APTES共價修飾后的硅膠中，分為如下步驟，（1）精確稱取1 g硅膠粉末，量取0．5 mLAPTES一起加入到50 mL甲苯體系中，在N2 保護下，油浴鍋中恒溫加熱回流反應12h；（2）將混懸液收集并在12009×5 min室溫條件下離心，棄上清，留沉淀；沉淀用HEPES 緩沖液(100 mM)清洗3次后80℃恒溫烘干，得干燥粉末；（3）干燥粉末加入500 mL 5％戊二醛甲醇溶液常溫攪拌2 h，此時溶液由白色變成磚紅色；在1200Gx 5 min室溫條件下離心，棄上清，留沉淀；沉淀用HEPES緩沖液清洗3次；（4）沉淀加入500 mL磷酸鈉溶液(100 mM，pH=8)常溫攪拌2 h，使反應后的基團展開，混懸液在12009×5 min室溫條件下離心，棄上清，留沉淀。

4.沉淀用HEPES緩沖液清洗3次；（5）沉淀在80℃恒溫條件下烘干，得干燥磚紅色粉末即為APTES共價修飾后的硅膠。