[發明專利]一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法

在審

• 申請號: 202011592318.5
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112666299A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 楊天逸
• 申請（專利權）人: 南通華葉生物科技集團有限公司
• 主分類號: G01N30/60
• 分類號: G01N30/60
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法，包括制備全細胞蛋白提取液、制備APTES共價修飾后的硅膠、細胞膜和硅膠鍵合及濕法裝柱四個步驟。本發明以具有活性的敗血癥細菌細胞膜及受體為固定相，利用細胞膜自身的融合作用和硅膠表面硅羥基(Si—OH)相互吸附制備成細胞膜色譜固定相，該方法最大限度地保持了細胞膜的完整性、膜受體的四級空間結構以及膜受體的生物活性。比現有篩選方法和技術更加精減，制作成本更低，可規模化生產，質量可控，性能優良，成本合理，能填補市場空缺，市場需求大，生產成本低，制備工藝成熟，同時能完全保證生產質量安全，有效地降低了投資門檻和投資風險。

技術領域

本發明涉及生物領域，特別是一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法。

背景技術

細菌感染是致病菌侵入血液系統，并能在血中生長繁殖，產生大量毒素進而引發急性全身性感染。該病危害性大、易導致死亡。因此，快速篩選出引發感染的細菌的特效藥，確定抗生素的選擇和使用，能減少盲目用藥，縮短患者治療時間。現有技術中由于技術限制，對于快速篩選出引發感染的細菌的特效藥還存在較大缺點，不能滿足實際需要。

發明內容

為了克服現有技術中存在的如背景所述弊端，本發明提供了采用高表達的敗血癥細菌細胞膜為主原料，比現有篩選方法和技術更加精減，制作成本更低，可規模化生產，質量可控，性能優良，成本合理，能填補市場空缺，市場需求大，生產成本低，制備工藝成熟，同時能完全保證生產質量安全，有效地降低了投資門檻和投資風險的一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種高效篩選細菌感染特效藥的細胞膜色譜柱制備方法，其特征在于包括制備全細胞蛋白提取液、制備APTES共價修飾后的硅膠、細胞膜和硅膠鍵合及濕法裝柱四個步驟；所述全細胞蛋白提取液制備中，采用變性裂解液以及非變性裂解液作為試劑，采用離心機、1.5ml離心試管和中部具有一道隔膜的50ml柱形聚乙烯離心試管作用提取工具，經以下幾個步驟制得，第一步：把細胞放于1.5ml離心試管中，并加入1ml的PBS細胞洗滌溶液，然后用離心機離心3分鐘，棄除上清，離心、棄除上清流程共重復三次，第二步，根據細胞沉淀體積加入預冷的PBS細胞洗滌溶液，進行細胞重懸，第三步，根據離心試管內細胞量加入變性裂解液，震蕩15s，第四步，將震蕩后裂解液轉移于50ml柱形聚乙烯離心試管內，離心機離心30s后，收集管底的裂解液即為全細胞蛋白提取液；所述制備APTES共價修飾后的硅膠中，用有特定蛋白高表達的細胞制備細胞膜層析柱，加入其抑制劑，使用ph7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌，以去除非特異性結合的雜質，隨后采用ph3.3的磷酸鹽緩沖液洗脫緩沖液，收集洗脫液，經濃縮后，高效液相檢測；所述細胞膜和硅膠鍵合中，在真空渦旋的條件下，將細胞膜懸液和硅膠常溫下混合反應5 rain，然后冰浴條件下攪拌50 rain，得到的細胞膜．硅膠混懸液，置于4℃冰箱中靜置過夜；所述濕法裝柱中，采用Waters996．515型液相泵，以PBS緩沖液為流動相將細胞膜．硅膠混懸液裝填到細胞膜色譜柱芯中，梯度升速，0．5 min：0．2—1．0 mL／min，然后在O．2 mL／min流速下平衡30 rain，從而得到穩定的柱壓；細胞膜色譜柱浸泡在PBS緩沖液中，4℃條件下保存備用。

進一步地，所述制備APTES共價修飾后的硅膠中，硅膠表面含有豐富的硅羥基(Si—OH)，先和(3．氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反應后鏈接上了氨基，然后和戊二醛反應，鏈接上一個醛基；細胞膜是由豐富的磷脂構成的，因此含有大量氨基；鍵合了醛基的硅膠和細胞膜上氨基發生氨醛縮合反應，從而使硅膠和細胞膜以共價的方式結合。