[發(fā)明專利]體外誘導(dǎo)產(chǎn)生人胰島β細胞的培養(yǎng)基體系及方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011589147.0 | 申請日： | 2020-12-29 |
| 公開（公告）號： | CN112522181B | 公開（公告）日： | 2023-02-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 蔣永平;沈斌;戴衛(wèi) | 申請（專利權(quán)）人： | 蘇州方舟生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071;C12N5/0775;A61K35/39;A61P3/10 |
| 代理公司： | 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237 | 代理人： | 肖明芳 |
| 地址： | 215126 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 體外 誘導(dǎo) 生人 胰島 細胞 培養(yǎng)基 體系 方法 | ||
本發(fā)明公開一種體外誘導(dǎo)產(chǎn)生人胰島β細胞的培養(yǎng)基體系，并進一步公開了上述培養(yǎng)基體系在體外誘導(dǎo)制備具有胰島素分泌功能的人胰島β細胞上的應(yīng)用。通過使用細胞匯合度在80%~?90%，第3~4代的BM?MSC誘導(dǎo)產(chǎn)生IPCs，采用優(yōu)化的逐級培養(yǎng)方案誘導(dǎo)BM?MSCs體外分化為IPCs，分五個階段進行培養(yǎng)，接受分化的IPCs移植后葡萄糖依賴性的胰島素的產(chǎn)，同時，從患者骨髓中獲得的間充質(zhì)干細胞可以增殖、誘導(dǎo)并分化為IPCs，隨后可移植到同一患者體內(nèi)。這種方法可以克服異體胰島細胞移植治療糖尿病的供體不足和免疫排斥等副反應(yīng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及體外誘導(dǎo)產(chǎn)生人胰島β細胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
糖尿病已成為威脅人類健康的主要疾病之一，給全世界數(shù)百萬人帶來沉重的負擔。糖尿病是由絕對(1型糖尿病)或相對(2型糖尿病)胰島素缺乏引起的。這兩種類型糖尿病發(fā)生高血糖和發(fā)展綜合征的主要決定因素都是功能胰腺β細胞數(shù)量的不足。目前治療1型糖尿病的方法是通過多次注射或微量注射給予外源性胰島素，這些方法無法模擬胰島β細胞在體內(nèi)對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的精確和動態(tài)調(diào)節(jié)，導(dǎo)致許多糖尿病患者出現(xiàn)高血壓和心血管疾病。
胰腺或胰島的移植可以幫助患者恢復(fù)生理血糖控制，消除嚴重低血糖，提高生活質(zhì)量，是一種很有前景的治療方法。近年來，再生醫(yī)學領(lǐng)域集中精力從胚胎來源的干細胞、臍帶血、臍帶膠樣組織或多種成人組織中分化，制備葡萄糖敏感的、能夠產(chǎn)生胰島素的細胞(IPCs)。然而，由于患者對移植物的免疫排斥作用或自身的胰島缺乏，胰島移植在臨床上的應(yīng)用受到限制。
最近的研究表明，骨髓(BM)來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)有分化為胰腺β細胞的潛能。其通常從成年人身上采集，可以很容易地用于自體移植，不存在胚胎組織固有的倫理問題，在治療糖尿病的臨床應(yīng)用中前景廣闊，開發(fā)一種有效的從BM-MSCs，體外制備IPCs的方案，具有成本低、無倫理問題、副作用少等優(yōu)點，將在臨床上為糖尿病患者提供更為安全有效的治療途徑。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種體外誘導(dǎo)產(chǎn)生人胰島β細胞的培養(yǎng)基體系及其應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種體外誘導(dǎo)產(chǎn)生人胰島β細胞的培養(yǎng)基體系，包含如下五階段培養(yǎng)基：
第一階段培養(yǎng)基為含有0.1-0.3％(v/v)HSA、40-60ng/mL激活素A(activin A)、20-30ng/mL Wnt3a(蛋白，RD systems)和40-60μM LY294002(50μM，PI3Kα，δ和β抑制劑，Abcam)的低糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco)；
第二階段培養(yǎng)基為含有0.5-2％(v/v)B27、30-60ng/mL角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、5-15mM煙酰胺的RPMI培養(yǎng)基；
第三階段培養(yǎng)基為含有0.5-2％(v/v)B27、5-15mm煙酰胺、10-30ng/mL表皮生長因子(EGF)、1-3μM全反式維甲酸(RA)，40-60ng/mL Noggin蛋白、0.2-0.3μM 3-酮-N-(氨基乙基-氨基己基-二氫肉桂基)(KAAD)-環(huán)巴胺(CYC)(Stemgent 04-0028)的低糖DMEM培養(yǎng)基；
第四階段培養(yǎng)基為含有0.5-2％(v/v)B27、5-15mM煙酰胺、40-60ng/mL胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的高糖DMEM培養(yǎng)基；
第五階段培養(yǎng)基為含有0.5-2％(v/v)B27、8-15mM煙酰胺、40-60ng/mL IGF和40-60ng/mL Exendin-4(腸促胰島素類似物)的CMRL培養(yǎng)基。
所述培養(yǎng)體系包含如下五階段培養(yǎng)基：
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