[發明專利]體外誘導產生人胰島β細胞的培養基體系及方法有效
| 申請號： | 202011589147.0 | 申請日： | 2020-12-29 |
| 公開（公告）號： | CN112522181B | 公開（公告）日： | 2023-02-17 |
| 發明（設計）人： | 蔣永平;沈斌;戴衛 | 申請（專利權）人： | 蘇州方舟生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071;C12N5/0775;A61K35/39;A61P3/10 |
| 代理公司： | 江蘇圣典律師事務所 32237 | 代理人： | 肖明芳 |
| 地址： | 215126 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 體外 誘導 生人 胰島 細胞 培養基 體系 方法 | ||
1.一種體外誘導產生人胰島β細胞的培養基體系，其特征在于，包含如下五階段培養基：
第一階段培養基為添加有 0.1-0.3%（v/v）HSA、40-60 ng/mL 激活素A、20-30 ng/mLWnt3a和40-60 μM LY294002的低糖DMEM培養液；
第二階段培養基為添加有0.5-2 %（v/v）B27、30-60 ng/mL角質形成細胞生長因子、5-15 mM煙酰胺的RPMI培養基；
第三階段培養基為添加有0.5-2 %（v/v）B27、5-15mm煙酰胺、10-30 ng/mL表皮生長因子、1-3 μM全反式維甲酸、40-60 ng/mL Noggin蛋白、0.2-0.3 μM 3-酮- N -(氨基乙基-氨基己基-二氫肉桂基) -環巴胺的低糖DMEM培養基；
第四階段培養基為添加有0.5-2%（v/v）B27、5-15 mM煙酰胺、40-60 ng/mL胰島素樣生長因子-1的高糖DMEM培養基；
第五階段培養基為添加有0.5-2%（v/v）B27、8-15 mM煙酰胺、40-60 ng/mL IGF和40-60ng/mL腸促胰島素類似物Exendin-4的CMRL培養基。
2.根據權利要求1所述的培養基體系，其特征在于，包含如下五階段培養基：
第一階段培養基為添加有 0.1%（v/v）HSA、50 ng/mL 激活素A、25 ng/mL Wnt3a和50 μM LY294002的低糖DMEM培養液；
第二階段培養基為添加有1%（v/v）B27、50 ng/mL角質形成細胞生長因子、10 mM煙酰胺的RPMI培養基；
第三階段培養基為添加有1%（v/v）B27、10mm煙酰胺、20 ng/mL表皮生長因子、2 μM全反式維甲酸，50 ng/mL Noggin蛋白、0.25μM 3-酮- N -(氨基乙基-氨基己基-二氫肉桂基) -環巴胺的低糖DMEM培養基；
第四階段培養基為添加有1%（v/v）B27、10 mM煙酰胺和50 ng/mL胰島素樣生長因子-1的高糖DMEM培養基；
第五階段培養基為添加有1%（v/v）B27、10 mM煙酰胺、50 ng/mL IGF和50 ng/mL腸促胰島素類似物Exendin-4的CMRL培養基。
3.利用權利要求1所述的培養基體系在體外誘導制備具有胰島素分泌功能的人胰島β細胞上的方法。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，使用細胞匯合度在80%~-90%，第3~4代的人BM-MSC誘導產生IPCs，然后采用優化的逐級培養方案誘導人BM-MSCs體外分化為IPCs，依次使用第一階段培養基、第二階段培養基、第三階段培養基、第四培養基和第五階段培養基進行培養，每一階段每隔一天更換新鮮培養基。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，分五個階段采用逐級培養方案誘導人BM-MSCs體外分化為IPCs：
第一階段，細胞培養在第一階段培養基中培養4天；
第二階段，培養基改為第二階段培養基，培養4天；
第三階段，培養基更換為第三培養基繼續培養4天；
第四階段，細胞轉移至低吸附六孔板，在第四培養基中培養4天；
第五階段，細胞在第五階段培養基中再培養6天；
其中，上述每一階段每隔一天更換新鮮培養基。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于，第一階段培養基為添加有 0.1%（v/v）HSA、50 ng/mL 激活素A、25 ng/mL Wnt3a和50 μM LY294002的低糖DMEM培養液；
第二階段培養基為添加有1%（v/v）B27、50 ng/mL角質形成細胞生長因子、10 mM煙酰胺的RPMI培養基；
第三階段培養基為添加有1%（v/v）B27、10mm煙酰胺、20 ng/mL表皮生長因子、2 μM全反式維甲酸、50 ng/mL Noggin蛋白、0.25μM 3-酮- N -(氨基乙基-氨基己基-二氫肉桂基) -環巴胺的低糖DMEM培養基；
第四階段培養基為添加有1%（v/v）B27、10 mM煙酰胺和50 ng/mL胰島素樣生長因子-1的高糖DMEM培養基；
第五階段培養基為添加有1%（v/v）B27、10 mM煙酰胺、50 ng/mL IGF和50 ng/mL腸促胰島素類似物Exendin-4的CMRL培養基。
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