[發明專利]柑橘黃龍病病原菌的試管培養方法

有效

• 申請號: 202011587109.1
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112725225B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 雷天剛;陳善春;何永睿;周常勇;彭愛紅;許蘭珍;鄒修平;姚利曉;李強;龍琴
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01G2/30;C12R1/01
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 張建

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種柑橘黃龍病病原菌的試管培養方法。所述培養方法，包括：柑橘黃龍病病原菌培養方法，其特征在于，包括：(1)柑橘黃龍病毒源準備；(2)毒源材料表面消毒處理；(3)試管砧木準備和嫁接接種；(4)增殖培養；所述增殖培養包括以下步驟：MS液體培養基配制，向培養基中添加多菌靈，分裝到帶濾紙橋的試管中，滅菌；隨后采用試管嫁接法接種黃龍病病原菌，切取經消毒處理的毒源材料的腋芽，嫁接于柑橘試管砧木上；然后將嫁接苗放入濾紙橋中；再于24?28℃暗室培養14～21d，待試管嫁接帶菌芽的萌芽長至0.5?1.0cm時，轉入12?16h的光周期下培養。本發明的方法重現性好；可使柑橘黃龍病病原菌短時間內增殖到高濃度水平。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種柑橘黃龍病病原菌的試管培養方法。

背景技術

柑橘黃龍病(Citrus?Huanglongbing,HLB)是由韌皮部桿菌屬細菌(CandidatusLiberobacter?sp.)侵染引起的柑橘生產上的毀滅性的病害，當前正在世界柑橘產區迅速蔓延，已成為制約柑橘產業健康發展的關鍵因素之一(“柑橘黃龍病病原培養及分子檢測技術研究進展”，宋曉兵等，廣東農業科學，2013年第23期，第65頁摘要第1-2行，公開日2013年12月31日；“柑橘黃龍病病原研究進展”，胡文召等，植物保護，2010年第36卷第3期，第30頁左欄第1段第1-2行，公開日2010年12月31日)。

目前，柑橘黃龍病病原被認為是一種韌皮部限制性寄生的ɑ-變形菌綱(Alphaproteobacteria)革蘭氏陰性細菌，根據病原菌16S?rDNA序列特征和β操縱子基因的序列特征，以及傳播媒介和病原熱敏性等，可將其柑橘黃龍病病原菌分為亞洲種(Candidatus?Liberibacter?asiaticus，CLas)、非洲種(Candidatus?Liberibacterafricanus，CLaf)和美洲種(Candidatus?Liberibacter?americannus，CLam)3個種(“柑橘黃龍病病原培養及分子檢測技術研究進展”，宋曉兵等，廣東農業科學，2013年第23期，第65頁左欄第2段第1-8行，公開日2013年12月31日)。其中，CLas在全球范圍內分布最廣，對柑橘產業造成的損失也最大，我國柑橘的黃龍病病原菌也為該種。

長期以來，研究者一直在努力探索柑橘黃龍病病原菌的培養方法。然而，采用現有方法培養柑橘黃龍病病原菌，重現性差，且病原菌不能快速增殖到高濃度水平。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種柑橘黃龍病病原菌的試管培養方法。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

柑橘黃龍病病原菌培養方法，其包括：(1)柑橘黃龍病毒源準備；(2)毒源材料表面消毒處理；(3)試管砧木準備和嫁接接種；(4)增殖培養；所述增殖培養包括以下步驟：配制MS液體培養基，向培養基中添加多菌靈，分裝到帶濾紙橋的試管中，滅菌；隨后采用試管嫁接法接種黃龍病病原菌，切取經消毒處理的毒源材料的腋芽，嫁接于柑橘試管砧木上；然后將嫁接苗放入濾紙橋中；再于24-28℃暗室培養14～21d，待試管嫁接帶菌芽的萌芽長至0.5-1.0cm時，轉入12-16h的光周期下培養。

本發明中，所述黃龍病病原菌為亞洲種。

本發明中，于24-28℃暗室培養過程中，若兩周后嫁接的芽未萌芽，用無菌脫脂棉蘸濃度100-200ppm的GA₃涂抹芽眼，并抹除砧木上的萌蘗。

進一步，所述多菌靈的用量為使其終濃度為0.15-0.3wt％。

進一步，所述柑橘黃龍病毒源準備包括以下步驟：

從田間感染黃龍病植株上采枝條，選擇有部分葉片顯癥、表面無病蟲害損傷且粗細適中的枝條，枝條上保留2-3片葉，以黃龍病菌檢測為陽性的枝條直接用作病原菌(CLas)試管接種的毒源。