[發明專利]柑橘黃龍病病原菌的試管培養方法

有效

• 申請號: 202011587109.1
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112725225B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 雷天剛;陳善春;何永睿;周常勇;彭愛紅;許蘭珍;鄒修平;姚利曉;李強;龍琴
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01G2/30;C12R1/01
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 張建

1.柑橘黃龍病病原菌培養方法，其特征在于，包括：(1)柑橘黃龍病毒源準備；(2)毒源材料表面消毒處理；(3)試管砧木準備和嫁接接種；(4)增殖培養；所述增殖培養包括以下步驟：配制MS液體培養基，向培養基中添加多菌靈，分裝到帶濾紙橋的試管中，滅菌；隨后采用試管嫁接法接種黃龍病病原菌，切取經消毒處理的毒源材料的腋芽，嫁接于柑橘試管砧木上；然后將嫁接苗放入濾紙橋中；再于24-28℃暗室培養14～21d，待試管嫁接帶菌芽的萌芽長至0.5-1.0cm時，轉入12-16h的光周期下培養；其中所述柑橘黃龍病毒源準備包括以下步驟：從田間感染黃龍病植株上采枝條，選擇有部分葉片顯癥、表面無病蟲害損傷的枝條，枝條上保留2-3片葉，以黃龍病菌檢測為陽性的枝條直接用作病原菌CLas試管接種的毒源；或事先準備好1年生左右的溫網室中保存的柑橘實生苗，從田間感黃龍病柑橘植株上取枝條，取雙芽枝段嫁接在實生苗上，繼續保存在溫室中按照常規的柑橘育苗方法進行管理；在嫁接接種黃龍病病原菌后3個月左右，對傳毒的柑橘實生苗進行黃龍病病原菌CLas檢測，以檢測為陽性的植株枝條作為試管苗接種毒源；

所述毒源材料表面消毒處理包括以下步驟：從感黃龍病柑橘植株上取枝條，減去葉片和刺，用棉花蘸洗滌劑原液仔細擦拭枝條，自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上用無菌水漂洗，酒精溶液浸泡，隨后用無菌水漂洗；然后用HgCl₂溶液浸泡；再用無菌水沖洗后備用。

2.根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述多菌靈的用量為使其終濃度為0.15％-0.3wt％。

3.根據權利要求1或2所述的培養方法，其特征在于，所述酒精溶液的濃度為75％，以體積百分比計，酒精溶液的浸泡時間為60s。

4.根據權利要求1或2所述的培養方法，其特征在于，所述HgCl₂溶液的濃度為0.1wt％，HgCl₂溶液的浸泡時間為8-10min。

5.根據權利要求1或2所述的培養方法，其特征在于，所述試管砧木準備包括以下步驟：

取出柑桔種子，清水洗凈，消毒后，無菌水沖洗；隨后剝去外種皮，接種在已消毒的MS固體培養基中；然后在26-28℃黑暗條件下培養2～3周，獲得試管砧木。

6.根據權利要求5所述的培養方法，其特征在于，所述柑桔種子的消毒包括以下步驟：

用酒精表面消毒后，再用0.1wt％的升汞或4wt％二氯異氰尿酸鈉消毒10分鐘。