[發(fā)明專利]一種基于宏基因組測序的真菌定量檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011581433.2
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112501347A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉文蘭;徐跡;黃建林
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市第二人民醫(yī)院(深圳市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12Q1/06
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 潘登

本發(fā)明提供了一種基于宏基因組測序的真菌定量檢測方法，所述方法包括以下步驟：(1)向樣本中依次加入皂苷和核酸內(nèi)切酶，去除宿主基因組；(2)將去除了宿主基因組的樣本進(jìn)行破壁處理，提取核酸，獲得真菌基因組；(3)將所述真菌基因組進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)；(4)將原始測序數(shù)據(jù)與真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)行真菌鑒定和豐度檢測。本發(fā)明在高通量測序前首先采用皂苷和核酸內(nèi)切酶去除樣本中的宿主DNA，顯著降低了人源基因組的比例和對測序結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾，配合破壁處理操作，提高了真菌基因組的比例，降低了測序成本，在真菌檢測領(lǐng)域具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于宏基因組測序的真菌定量檢測方法。

背景技術(shù)

近年來，高通量測序技術(shù)(又稱感染宏基因組測序，meta next generationsequencing，簡稱mNGS)越來越多地應(yīng)用于病原菌檢測，該方法不僅不依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)，而且可以一次性檢測樣本環(huán)境中的所有微生物遺傳信息，對于提供病原菌的分型信息和豐度信息，具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢。

mNGS技術(shù)具有極高的臨床應(yīng)用前景，同時也面臨著嚴(yán)峻的問題，主要表現(xiàn)在測序結(jié)果中人源reads比例高，基因背景干擾大，表現(xiàn)出GC偏好性，所謂GC偏好性即優(yōu)先擴增基因組中GC含量較低的片段，使得不同片段的擴增效率不同，可能導(dǎo)致重要病原菌的漏測或者少測，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，測序讀長中比例過高的人源reads，影響了測序效率，提高了測序成本。

因此，有必要構(gòu)建一種準(zhǔn)確、快速、成本低的病原菌檢測方法，在病原微生物檢測領(lǐng)域具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和實際需求，本發(fā)明提供了一種基于宏基因組測序的真菌定量檢測方法，通過富集樣本中的病原微生物，降低宿主基因的比例，從而避免測序偏好性，提高測序準(zhǔn)確性，并降低測序數(shù)據(jù)量和測序成本。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種基于宏基因組測序的真菌定量檢測方法，所述方法包括以下步驟：

(1)向樣本中依次加入皂苷和核酸內(nèi)切酶，去除宿主基因組；

(2)將去除了宿主基因組的樣本進(jìn)行破壁處理，提取核酸，獲得真菌基因組；

(3)將所述真菌基因組進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)；

(4)將原始測序數(shù)據(jù)與真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)行真菌鑒定和豐度檢測。

本發(fā)明中，在高通量測序前首先采用皂苷和核酸內(nèi)切酶去除樣本中的宿主DNA，其中，皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，可與膽甾醇結(jié)合生成不溶性分子，破壞血紅細(xì)胞的滲透性，本發(fā)明采用皂苷處理樣本，破壞宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放宿主基因組DNA，配合使用核酸內(nèi)切酶消化釋放的宿主DNA，顯著降低了人源基因組的比例和對測序結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾，提高了微生物基因組的比例，有效測序數(shù)據(jù)量大幅提升，提高了測序效率，降低了測序成本。

本發(fā)明中，對去除了宿主基因組的樣本進(jìn)行破壁處理，破壞真菌細(xì)胞壁，并減少真菌細(xì)胞壁中多糖成分對核酸提取的影響，操作簡便成本低廉，顯著提高了真菌基因組的提取效率。

本發(fā)明中，去除宿主基因組步驟和降解真菌細(xì)胞壁步驟相互配合，顯著提高了真菌基因組在樣本中的比例，提高了測序準(zhǔn)確性。

優(yōu)選地，步驟(1)所述樣本包括血液樣本、唾液樣本、糞便樣本、尿液樣本或土壤樣本中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟(1)所述皂苷的終濃度為1％～3％，例如可以是1％、2％或3％。

本發(fā)明中，終濃度為1％～3％的皂苷對樣本中的宿主細(xì)胞具有良好的破壞作用，濃度過低不能充分破壞宿主細(xì)胞，濃度過高對核酸提取具有一定的影響，也可能對微生物細(xì)胞造成破壞。