[發明專利]一種基于宏基因組測序的真菌定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011581433.2
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112501347A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 劉文蘭;徐跡;黃建林
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院(深圳市轉化醫學研究院)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12Q1/06
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 潘登

1.一種基于宏基因組測序的真菌定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)向樣本中依次加入皂苷和核酸內切酶，去除宿主基因組；

(2)將去除了宿主基因組的樣本進行破壁處理，提取核酸，獲得真菌基因組；

(3)將所述真菌基因組進行文庫構建和高通量測序，獲得原始測序數據；

(4)將原始測序數據與真菌數據庫進行比對，進行真菌鑒定和豐度檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述樣本包括血液樣本、唾液樣本、糞便樣本、尿液樣本或土壤樣本中的任意一種或至少兩種的組合。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述皂苷的終濃度為1％～3％；

優選地，步驟(1)所述皂苷處理樣本的溫度為20～25℃；

優選地，步驟(1)所述皂苷處理樣本的時間為10～15min。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述核酸內切酶包括DNaseI；

優選地，步驟(1)所述核酸內切酶的終濃度為1％～3％；

優選地，步驟(1)所述核酸內切酶處理樣本的溫度為35～40℃；

優選地，步驟(1)所述核酸內切酶處理樣本的時間為30～60min。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述破壁處理包括超聲破壁處理和/或微波破壁處理；

優選地，所述超聲破壁處理的功率為100～500W；

優選地，所述超聲破壁處理的時間為20～40min；

優選地，所述微波破壁處理的功率為500～1000W；

優選地，所述微波破壁處理的時間為80～120s。

6.根據權利要求1-5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述文庫構建包括對微生物基因組進行片段化、末端補平和3’端加A尾、連接接頭和PCR擴增；

優選地，所述片段化為對微生物基因組進行超聲處理；

優選地，所述超聲處理的功率為50～55W；

優選地，所述超聲處理的溫度為15～25℃；

優選地，所述超聲處理的時間為6～12min。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述末端補平和3’端加A尾為采用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶處理片段化核酸；

優選地，所述末端補平和3’端加A尾的條件為20～25℃保持5～15min，70～75℃保持5～15min。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述接頭包括P7接頭和P5接頭；

優選地，所述連接接頭的條件為20～25℃保持10～20min；

優選地，所述PCR擴增的條件為92～96℃預變性1～5min；95～98℃變性5～20s，60～65℃退火20～40s，70～75℃延伸20～40s，共進行5～8個循環；70～75℃延伸1～3min；0～4℃終止反應。

9.根據權利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述真菌數據庫來源于公共數據庫。

10.根據權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)向樣本中加入終濃度為1％～3％的皂苷，20～25℃下孵育10～15min，隨后加入終濃度為1％～3％的DNaseI，35～40℃下孵育30～60min，去除宿主基因組；

(2)將去除了宿主基因組的樣本進行超聲破壁處理和/或微波破壁處理，所述超聲破壁處理為將樣本在100～500W功率下超聲20～40min，所述微波破壁處理為將樣本在500～1000W功率下微波80～120s，提取核酸，獲得真菌基因組；

(3)將所述真菌基因組在15～25℃條件下進行50～55W超聲片段化，并采用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶處理片段化核酸，隨后加入P7接頭和P5接頭進行接頭連接反應，對含有接頭的模板進行PCR擴增，構建測序文庫進行高通量測序，獲得原始測序數據；

(4)將原始測序數據與NCBI真菌數據庫進行比對，進行真菌鑒定和豐度檢測。