[發明專利]一種重組蛋白及其表達方法、純化方法及用途

在審

• 申請號: 202011580950.8
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN114685676A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 朱傳鳳;瓦曉霞;馬超;李雄雄;傅生芳;王婉
• 申請（專利權）人: 蘭州生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/85;C07K1/18;C07K1/16;A61K39/155;A61P31/14;G01N33/569
• 代理公司: 北京知聯天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11594
• 代理人: 史光偉;張迎新

本發明涉及一種重組蛋白及其表達方法、純化方法及用途。重組蛋白為RSV的F蛋白，即RSV?F，所述RSV?F的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1，所述RSV?F蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。所述重組蛋白的表達方法包括：1)RSV?F編碼片段的擴增；2)根據擴增后的RSV?F編碼片段構建包含F蛋白的亞克隆質粒；3)根據所述亞克隆質粒構建RSV?F的真核表達質粒；4)轉染所述RSV?F的真核表達質粒于HEK293E細胞中，在培養基中培養。所述重組蛋白的純化經陰離子交換柱純化、陽離子交換柱純化以及凝膠過濾色譜柱純化。純化后的RSV?F重組蛋白，具有免疫原性，可用于RSV亞單位疫苗的研發或者RSV感染的免疫診斷。

技術領域

本發明屬于涉及生物技術領域，特別涉及一種重組蛋白及其表達方法、純化方法及用途。

背景技術

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起嬰幼兒急性下呼吸道疾病的最主要的病原。全世界每年有3400多萬5歲以下的兒童遭受RSV的感染，其中約340萬住院，16-20萬人死亡，且99％RSV感染的致死病例發生在中低收入的發展中國家。24個月以內的嬰兒幾乎都感染過一次RSV，3歲以下所有兒童被RSV感染，并在一生中多次重復感染。在全球范圍內，RSV導致1歲以下嬰幼兒死亡率達6.7％，是瘧疾外的第二致死病因。此外老年人和免疫功能低下的患者也易遭受RSV的感染，RSV引起的疾病負擔與非流行季的流感引起的疾病負擔相當。利巴韋林是用于治療RSV疾病的抗病毒的藥物，但是它的療效不確定性、價格高和難以施用，僅限于癥狀嚴重的病人。帕麗珠單抗是被動預防RSV疾病的單克隆抗體，它可有效降低RSV引起的住院率，但其價格昂貴，需每月注射，目前僅施用于發達國家中RSV疾病高風險的嬰幼兒。嚴重RSV疾病負擔迫切需要研發RSV的疫苗，為此，RSV疫苗被世界衛生組織列為全球最優先研發的疫苗之一。

F蛋白為呼吸道合胞病毒表面的糖蛋白，屬于I型糖蛋白。在細胞內合成無活性的前體F0，在成熟的過程中，F0由弗林酶切割形成F2(aa1-109)，P27(aa110-136)和F1(aa137-574)，F2與F1以二硫鍵形成異源二聚體即F蛋白的單體，三個單體組裝形成三聚體。呼吸道合胞病毒包膜上的功能F蛋白以不穩定的融合前構象存在，在尚未探明的因素啟動下，折疊形成穩定的融合后構象。F蛋白介導病毒和宿主細胞膜的融合，為病毒侵入細胞所必須。RSV兩個亞型F蛋白序列高度保守，同源性高達90％以上；F蛋白的單克隆抗體已被證明能降低高風險嬰幼兒重度RSV疾病的發病率，已被批準用于嬰幼兒RSV疾病的預防，所以F蛋白是研發疫苗主要靶抗原。

由于F蛋白為包膜蛋白，通過體外培養病毒并裂解病毒，可以獲得的F蛋白，但其產率較低；且在F蛋白的純化過程中易喪失其活性。為了研發F蛋白疫苗必須建立F蛋白制備和純化的新方法。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種重組蛋白及其表達方法、純化方法及用途。

一種重組蛋白，

所述重組蛋白為RSV的F蛋白，即RSV-F；

所述RSV-F的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1。

進一步地，

所述RSV-F蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

進一步地，

一種重組蛋白的表達方法，所述方法包括：

(1)RSV-F編碼片段的擴增；

(2)根據擴增后的RSV-F編碼片段構建包含F蛋白的亞克隆質粒；

(3)根據所述亞克隆質粒構建RSV-F的真核表達質粒；

(4)轉染所述RSV-F的真核表達質粒于HEK293E細胞中，在培養基中培養。