[發明專利]一種重組蛋白及其表達方法、純化方法及用途

在審

• 申請號: 202011580950.8
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN114685676A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 朱傳鳳;瓦曉霞;馬超;李雄雄;傅生芳;王婉
• 申請（專利權）人: 蘭州生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/85;C07K1/18;C07K1/16;A61K39/155;A61P31/14;G01N33/569
• 代理公司: 北京知聯天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11594
• 代理人: 史光偉;張迎新

1.一種重組蛋白，其特征在于，

所述重組蛋白為RSV的F蛋白，即RSV-F；

所述RSV-F的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1。

2.根據權利要求1所述重組蛋白，其特征在于，

所述RSV-F蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

3.一種權利要求2所述重組蛋白的表達方法，其特征在于，

所述方法包括：

(1)RSV-F編碼片段的擴增；

(2)根據擴增后的RSV-F編碼片段構建包含F蛋白的亞克隆質粒；

(3)根據所述亞克隆質粒構建RSV-F的真核表達質粒；

(4)轉染所述RSV-F的真核表達質粒于HEK293E細胞中，在培養基中培養。

4.根據權利要求3所述的重組蛋白的表達方法，其特征在于，

所述RSV-F編碼片段的擴增是以優化的RSV-F核苷酸序列為模板，PCR擴增RSV-F片段。

5.根據權利要求4所述的重組蛋白的表達方法，其特征在于，

所述RSV-F核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1第nt94-nt1563。

6.根據權利要求4所述的重組蛋白的表達方法，其特征在于，

所述構建包含F蛋白的亞克隆質粒是將F蛋白與pGEM-Teasy載體連接，進而構建包含F蛋白的亞克隆質粒pTe-F。

7.根據權利要求6所述的重組蛋白的表達方法，其特征在于，

所述RSV-F的真核表達質粒將所述pTe-F與表達載體pSEC分別酶切純化后進行連接而構建。

8.根據權利要求3所述的重組蛋白的表達方法，其特征在于，

所述RSV-F的真核表達質粒通過Lipofectamine2000或PEI法轉染于HEK293E細胞中；

所述培養基為無血清培養基。

9.一種根據權利要求2所述重組蛋白的純化方法，其特征在于，

所述方法包括：

(1)RSV-F編碼片段的擴增；

(2)根據擴增后的RSV-F編碼片段構建包含F蛋白的亞克隆質粒；

(3)根據所述亞克隆質粒構建RSV-F的真核表達質粒；

(4)轉染所述RSV-F的真核表達質粒于HEK293E細胞中，在培養基中培養；

(5)收集培養液的上清RSV-F；

(6)將所述收集的上清RSV-F經Capto Q陰離子交換柱純化；

(7)將步驟(6)純化后的RSV-F進行Sepharose sp hp陽離子交換柱純化；

(8)將步驟(7)純化后的RSV-F進行Surperdex 200凝膠過濾色譜柱純化。

10.根據權利要求9所述的重組蛋白的純化方法，其特征在于，

所述陰離子交換柱純化使用A液平衡層析柱和層析系統，將A液稀釋的含目標蛋白的濃縮上清進行上樣，收集流穿液；

所述A液為NaH₂PO₄，Na₂HPO₄，pH 7.0。

11.根據權利要求9所述的重組蛋白的純化方法，其特征在于，

所述陰離子交換柱純化使用B液平衡層析柱和層析系統，使用C液進行線性梯度洗脫；

所述B液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0；C液為NaCl。

12.根據權利要求9所述的重組蛋白的純化方法，其特征在于，

所述凝膠過濾色譜柱純化使用D液平衡層析柱和層析系統，再用D液洗脫，去除痕量的雜蛋白；

所述D液為Tris緩沖液，NaCl，Tween 20，pH 7.4。

13.一種權利要求9純化后的重組蛋白的用途，其特征在于，

所述純化后的RSV-F重組蛋白具有免疫原性，可用于RSV亞單位疫苗的研發或者RSV感染的免疫診斷。