[發明專利]一種用于檢測II型草魚呼腸孤病毒的RT-RPA引物、探針、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 202011577941.3
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112680544B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 李瑩瑩;王慶;曾偉偉;王英英;尹紀元;吳斯宇;石存斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的實時熒光RT?RPA引物、探針和試劑盒及其應用。本發明通過基因Ⅱ型草魚呼腸孤病毒特定的保守區域設計篩選得到引物和探針的最佳組合，其檢測靈敏度高、特異性好、檢測效果穩定；而且與包括Ⅰ型GCRV和Ⅲ型GCRV在內的9種魚類常見病毒和草魚易感染細菌維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌均無交叉反應，表現出良好的特異性。基于本發明所建立的實時熒光RT?RPA引物、探針及檢測試劑盒，對于基因Ⅱ型草魚呼腸孤病毒檢測靈敏度為10¹copy/μl，檢測靈敏度比巢氏PCR方法高10倍，不需要大型儀器設備，檢測時間僅需4.5～30min，大大縮短了檢測時間，可用于現場快速檢測。

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測II型草魚呼腸孤病毒的RT-RPA引物、探針、試劑盒及檢測方法。

背景技術

草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤病毒科(Reoviridae)一新成員，屬水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)，是該屬中致病力最強的毒株之一，是中國大陸分離的第一株魚類病毒。該病毒主要引起中國、朝鮮、越南等亞洲國家淡水養殖主要品種草魚在魚種階段發生出血病，死亡率一般為30％～50％，最高可達60％～80％，還能感染青魚、麥穗魚和稀有鮈鯽等。該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發病季節長，嚴重威脅漁業生產。據不完全統計，每年由于草魚出血病導致的經濟損失至少達10億元，嚴重影響了廣大草魚養殖者的積極性和中國淡水養殖業的健康發展。

根據現有的分離株序列信息，進行核苷酸序列與氨基酸序列比對以及構建系統進化樹分析，所有毒株總體上可以分為3大類，即分別把這3類毒株按照基因序列差異分為Ⅰ型(代表株為GCRV-873與GCRV-873-JX09-01)、Ⅱ型(代表株為GCRV-HZ08與GCRV-GD10)和Ⅲ型(GCRV-104與GCRV-HB-1007)。初步的流行病學分析可以得出：目前主要流行的草魚呼腸孤病毒為Ⅱ型。

草魚出血病的防治工作任務非常艱巨，主要是對疫情要早發現、早確診、早控制、早防疫，而關鍵問題之一是早確診，也就是草魚呼腸孤病毒的快速檢測技術問題，只有建立快速、敏感、特異的草魚出血病診斷技術并應用到實際防治工作中去，才能真正解決“一線”急需。

草魚呼腸孤病毒的診斷方法有多種，各具優勢和缺陷，病毒分離、電鏡觀察、PCR、qPCR等核酸檢測方法至今仍是檢測草魚呼腸孤病毒普遍采用的方法，但這些方法費時費力、操作比較復雜，不能對病毒進行快速診斷，而且由于GCRV基因組為RNA，因此針對GCRV的核酸學檢測方法都需要提取RNA后繼續反轉錄，以獲得的cDNA為模板進行檢測，因此操作相對繁瑣，不利于草魚出血病的流行病學調查工作。對儀器設備及操作人員有一定要求，檢測大概需要2～5小時，很難實現現場快速、批量、簡便的檢測要求。

因此，基于現有技術中對于快速檢測草魚呼腸孤病毒的成本及技術缺陷，亟需一種能實現快速、高效、準確的檢測試劑及檢測試劑盒，以滿足實際生產需求。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種引物。

本發明的第二個目的在于提供一種探針。

本發明的第三個目的在于提供一種試劑盒。

本發明的第四個目的在于提供上述引物或探針或試劑盒在檢測II型草魚呼腸孤病毒中的應用。

本發明的第五個目的在于提供一種檢測II型草魚呼腸孤病毒的方法。

本發明所采取的技術方案是：

本發明的第一個方面，提供一種引物，所述引物用于檢測II型草魚呼腸孤病毒，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列選自：

1F：5’-CAAAGAAATTTTTCGCTTGTGATGTTGAC-3’(SEQ ID NO:1)；