[發(fā)明專利]一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構(gòu)建促進(jìn)植物黃酮醇苷合成的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011574754.X
• 申請(qǐng)日: 2020-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN112553249B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紀(jì)元;姜麗娜;范正琪;殷恒福;李辛雷;童冉;劉偉新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/02;A01H6/82
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構(gòu)建促進(jìn)植物黃酮醇苷合成的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括：1）克隆金花茶CnFLS和CnUFGT14基因；2）構(gòu)建雙基因載體；3）將雙基因載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙草；4）PCR鑒定轉(zhuǎn)基因煙草陽性株系，測(cè)定陽性株系中黃酮醇苷、多酚的含量。本發(fā)明通過過表達(dá)金花茶的CnFLS基因，同時(shí)過表達(dá)CnUFGT14基因的合理設(shè)計(jì)，將CnFLS基因促進(jìn)合成的黃酮醇，進(jìn)而被CnUFGT14基因糖苷化形成穩(wěn)定的黃酮醇苷，提高了植物中黃酮醇苷的含量，同時(shí)一定程度上抑制了多酚、花青苷的合成，進(jìn)而能使植物的花色變黃。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構(gòu)建促進(jìn)植物黃酮醇苷合成的方法。

背景技術(shù)

類黃酮廣泛存在于多數(shù)植物體內(nèi)，是大部分植物花色形成的決定性色素群，同時(shí)可提高植物的抗逆性等，還是一種天然有機(jī)抗氧化劑，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值。類黃酮是一大類次級(jí)代謝產(chǎn)物的統(tǒng)稱，主要存在于花瓣表皮組織細(xì)胞的液泡中，其中黃酮（flavone）、黃酮醇（flavonol）等屬黃色系，花青素（anthocyanin）屬紅色系，多酚（polyphenols）為無色系。

金花茶（Camellia nitidissima）花色金黃，不僅具有極高的觀賞價(jià)值，還是黃花茶花育種的珍稀遺傳資源。前人通過研究發(fā)現(xiàn)，金花茶花色形成的主要原因是花瓣中黃酮醇苷的含量較高導(dǎo)致的，而FLS基因（黃酮醇合酶基因）是黃酮醇合成的關(guān)鍵基因，但是前人僅是通過單獨(dú)過表達(dá)金花茶CnFLS基因，很難使模式植物的黃酮醇苷的含量顯著升高，進(jìn)行形成金黃色的花朵。

因FLS基因促進(jìn)合成的黃酮醇很不穩(wěn)定、容易分解，故需要UFGT基因（類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因）將其進(jìn)行糖苷化，從而形成穩(wěn)定的黃酮醇苷。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構(gòu)建促進(jìn)植物黃酮醇苷合成的方法。利用PCR擴(kuò)增得到金花茶的CnFLS、CnUFGT14基因，使用OSCR(one step clone reaction)克隆技術(shù)，進(jìn)行酶切構(gòu)建CnFLS+CnUFGT14的雙基因過表達(dá)載體，將得到的雙基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化本氏煙草，使陽性株系的黃酮醇苷含量得到顯著提高。

一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構(gòu)建促進(jìn)植物黃酮醇苷合成的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）克隆金花茶CnFLS和CnUFGT14基因；

2）構(gòu)建CnFLS+CnUFGT14雙基因載體；

3）將CnFLS+CnUFGT14雙基因載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙草；