[發明專利]一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構建促進植物黃酮醇苷合成的方法

有效

• 申請號: 202011574754.X
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112553249B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 李紀元;姜麗娜;范正琪;殷恒福;李辛雷;童冉;劉偉新
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/02;A01H6/82
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

1.一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構建促進植物黃酮醇苷合成的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）克隆金花茶CnFLS和CnUFGT14基因；

2）構建CnFLS+CnUFGT14雙基因載體；

3）將CnFLS+CnUFGT14雙基因載體轉入大腸桿菌，測序正確后，提取質粒轉入農桿菌中，采用農桿菌介導的葉盤法轉化本氏煙草；

4）采用PCR鑒定轉基因煙草陽性株系，利用HPLC方法測定陽性株系花朵的黃酮組分、多酚組分、花青素苷組分的含量，并計算黃酮總量、多酚總量、花青素苷總量。

2.如權利要求1所述的一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構建促進植物黃酮醇苷合成的方法，其特征在于所述步驟1）具體為：根據金花茶CnFLS和CnUFGT14基因的序列分別設計引物pFLS-F/pFLS-R和pUFGT14-F/ pUFGT14-R，使用ExTaq酶進行PCR擴增，獲得目的基因全長CDS序列，進行凝膠電泳分析檢測，回收純化，獲得CnFLS和CnUFGT14基因，所述引物pFLS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，引物pFLS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，引物pUFGT14-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，引物pUFGT14-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

3.如權利要求2所述的一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構建促進植物黃酮醇苷合成的方法，其特征在于所述PCR反應程序為：98℃預變性2min；98℃變性10 s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30個循環；72℃延伸5min。

4.如權利要求1所述的一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構建促進植物黃酮醇苷合成的方法，其特征在于所述步驟2）具體為：將CnFLS和CnUFGT14基因分別構建至帶有酶切位點的pBWA(V)和pBWD(LA)載體中，得到pBWA(V)KS-FLS、pBWD(LA)1C-UFGT14中間載體，采用OSCR克隆技術進行酶切連接后回收得到CnFLS+CnUFGT14雙基因載體。

5.如權利要求4所述的一種金花茶CnFLS+CnUFGT14雙基因載體構建促進植物黃酮醇苷合成的方法，其特征在于所述酶切體系為：Buffer: 2μL，BsmBI/Esp3I: 1μL，T4_ligase: 1μL，pBWA(V)KS-FLS: 4μL，pBWD(LA)1C-UFGT14: 4μL，H₂O: 8μL，Total:20μL；所述連接過程為：37℃ 20 min；37℃ 10 min，20℃ 10min，5個循環；37℃ 20 min；80℃ 5 min。