[發(fā)明專利]使用干細(xì)胞治療宮腔粘連的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011568877.2
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112587550B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉冰;李容;湯樂;王正;肖海蓉;陸偉峰
• 申請（專利權(quán)）人: 博雅干細(xì)胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;A61K35/28;A61K47/02;A61K47/18;A61P15/00;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.用于治療宮腔粘連的供注射方式使用的細(xì)胞制劑，其由如下組分組成：羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞3×10⁶個/ml、氯化鈉8.5mg/ml、泛酸鈣2.5mg/ml、鳥氨酸20mg/ml、藥用溶媒水；該細(xì)胞制劑是按照如下步驟的方法制備得到的：將氯化鈉、泛酸鈣和鳥氨酸用適量水溶解，得到鹽水溶液；將傳代培養(yǎng)所得間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中2000rpm離心5min，棄上清，加鹽水溶液使細(xì)胞重懸，制得細(xì)胞制劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞制劑，其中所述羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)傳代培養(yǎng)至1~15代的細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞制劑，其中所述羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)傳代培養(yǎng)至1~12代的細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞制劑，其中所述羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞是通過如下步驟的方法制備得到的：

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)沖洗表面，對胎盤進(jìn)行消毒處理；

(2)用手術(shù)鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎(chǔ)平衡鹽溶液反復(fù)清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；用300目濾網(wǎng)過濾，生理鹽水沖洗殘血，組織塊轉(zhuǎn)移至50ml離心管；

(3)組織消化：在37℃恒溫?fù)u床中，將組織塊用1倍組織體積的混合酶消化液以100rpm振蕩消化30~60min；消化結(jié)束后，加2ml胎牛血清混勻終止；用200目濾網(wǎng)過濾并用大量生理鹽水清洗，收集濾液；

(4)分別對濾液部分和組織塊部分進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)：

濾液部分：收集的濾液以1500rpm 離心5min，去上清，用生理鹽水重懸清洗細(xì)胞沉淀；以1500rpm 離心5min，去上清，將細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸；計數(shù)儀計取有核細(xì)胞數(shù)并用臺盼蘭染色測定細(xì)胞活率；以每瓶2×10⁶個細(xì)胞接種于75cm²培養(yǎng)瓶中，添加20ml完全培養(yǎng)基，晃勻后在5%CO₂、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；定期換液；培養(yǎng)10~15天后傳代至P1代，繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；

組織塊部分：將收集的組織塊置于75cm²培養(yǎng)瓶中，使組織塊能夠覆蓋培養(yǎng)瓶中一半的培養(yǎng)面積，添加完全培養(yǎng)基沒過組織，晃勻后于5%CO₂、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2d后補液10ml完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；較多間充質(zhì)干細(xì)胞爬出后去組織，定期換液；培養(yǎng)10~15天后傳代至P1代，繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；

(5)P1代細(xì)胞收獲：用胰酶消化液將上一步驟中的兩部分合并后的P1代細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞，計數(shù)并測定細(xì)胞活率，凍存，即得P1代的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，完成從P0代至P1代的細(xì)胞傳代；依次重復(fù)上述從P0代到P1代的傳代操作以分別進(jìn)行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的細(xì)胞傳代，得到P1代至P15代的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞制劑，所述基礎(chǔ)平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的：將0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.132g的Na₂HPO₄.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO₃、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞制劑，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型膠原酶，0.3mg/ml的II型膠原酶，0.1mg/ml的透明質(zhì)酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞制劑，所述DMEM-F12培養(yǎng)基是DMEM-F12以體積比1：1配制的培養(yǎng)基。

8.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞制劑，所述完全培養(yǎng)基包括：DMEM-F12培養(yǎng)基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素。

9.根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞制劑，所述的完全培養(yǎng)基中還添加了0.01~0.05%硝酸硫胺和0.05~0.1%麥芽糖。