[發(fā)明專利]一種香菇N7菌株的InDel標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011568629.8
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112795679A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于海龍;章爐軍;宋春艷;尚曉冬;譚琦;張美彥
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31287
• 代理人: 張竹梅

本發(fā)明涉及一種香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法，該指紋圖譜由7對基于香菇全基因組測序后開發(fā)的InDel標(biāo)記組成。本發(fā)明的香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜可用于香菇N7菌種的特異性鑒定，具有檢測時間短、準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性好的優(yōu)點，在收集的44個香菇菌種中具有香菇N7菌種的專一性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于香菇菌種的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)因具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，而備受消費者歡迎。中國是世界上最早進行香菇人工栽培的國家，栽培歷史已有800多年，目前香菇是國內(nèi)栽培最廣、產(chǎn)量最高的菇種。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2018年中國食用菌總產(chǎn)量為3842.04萬噸，其中香菇總產(chǎn)量為1043.12萬噸，占國內(nèi)食用菌總產(chǎn)量的27.15％，占世界香菇總產(chǎn)量的90％以上。為保障育種者的權(quán)益和降低生產(chǎn)者的風(fēng)險，促進我國香菇產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展，建立一種簡便、快速、可靠的香菇菌種特異性鑒定技術(shù)迫在眉睫。

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，DNA測序技術(shù)的不斷成熟，測序的通量在不斷增加而成本在降低。DNA分子標(biāo)記技術(shù)能夠從基因水平上檢測香菇菌種的遺傳特異性，香菇全基因組測序的完成為InDel標(biāo)記的開發(fā)提供了便利。InDel分子標(biāo)記是一種基于高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，降低了InDel標(biāo)記開發(fā)的成本，適用于香菇全基因組測序分子標(biāo)記的開發(fā)。且InDel標(biāo)記具有數(shù)量豐富、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好、快捷簡便等優(yōu)點，不僅用于分子標(biāo)記輔助育種，而且也可用于香菇菌株鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該指紋圖譜與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點。

本發(fā)明的一種香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜，該指紋圖譜由7對InDel標(biāo)記組成，是基于香菇基因組插入/缺失片段開發(fā)的InDel標(biāo)記引物，擴增帶型好，重復(fù)性高，標(biāo)記詳細(xì)信息如表1。

表1 InDel標(biāo)記引物信息列表

本發(fā)明還提供了一種香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜的應(yīng)用，是利用香菇基因組插入/缺失片段開發(fā)的7對InDel標(biāo)記引物，對香菇菌種進行InDel標(biāo)記擴增，將得到的帶型與N7菌種的帶型對照，與該帶型一致即為香菇N7菌種；

其中香菇N7菌種的帶型編號組合為：1211(1+2)(1+2)1。

通過對收集的44個香菇品種的InDel標(biāo)記引物帶型擴增，本發(fā)明確定了7對InDel標(biāo)記引物在44個香菇品種中擴增出的等位片段的數(shù)量并編號(表2)，通過不同InDel 等位位點的編號組合可有效識別N7菌種(圖2-8)。通過DNA分子量對照D2000 bp DNA ladder可確定各InDel標(biāo)記引物擴增的等位位點的相對分子量，存在N7菌種特異InDel 等位片段組合的菌種，即是香菇N7菌種，該菌種的編號組合為：1211(1+2)(1+2)1。

表2 InDel引物擴增的等位片段信息匯總表

本發(fā)明還提供了上述香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

(1)菌絲培養(yǎng)：將香菇菌絲轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA中，23～25℃下避光培養(yǎng)，10d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提取：用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度為20～30ng/uL；

CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：