[發(fā)明專(zhuān)利]一種香菇N7菌株的InDel標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011568629.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112795679A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于海龍;章?tīng)t軍;宋春艷;尚曉冬;譚琦;張美彥
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 上海容慧專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 31287
• 代理人: 張竹梅

1.一種香菇N7菌種的InDel標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括：

(1)菌絲培養(yǎng)：將香菇菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板上，25℃下避光培養(yǎng)，10d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提取：用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度為20～30ng/uL；CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：

①取冷凍干燥后的香菇菌絲于2mL離心管中，并放入2-3顆鋼珠；

②將離心管放入多樣品組織研磨機(jī)中，設(shè)置頻率60Hz，時(shí)間30s研磨至均勻粉末；

③加入65℃預(yù)熱1h的2×CTAB抽提液，于65℃保溫60min，間隔20min輕搖混勻一次；

④12000rpm、4℃離心20min，分裝上清液，分裝為兩管各800μL；

⑤在上述上清液中加入體積比為25：24：1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入新的離心管中；

⑥在上述離心管中加入體積比為24：1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；

⑦在上述離心管中加入相對(duì)于步驟⑥中上清液2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20℃下靜置沉淀1h，之后8000rpm、4℃離心10min，棄上清；

⑧將得到的沉淀加入1mL濃度為70％乙醇洗滌1次，8000rpm，室溫離心5min；

⑨棄乙醇，超凈工作臺(tái)中吹干；加入100μL 10×TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩將得到的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用；

(3)InDel分子標(biāo)記的檢測(cè)：對(duì)上述提取的DNA進(jìn)行開(kāi)發(fā)的InDel標(biāo)記的PCR擴(kuò)增；

PCR擴(kuò)增體系為：總體積20μL，包括：Premix Taq^TM(1.25U/25μL Taq DNA酶，0.4mM/LdNTP，0.3mM/L PCR buffer)10uL，10μmol/L InDel標(biāo)記正向引物和反向引物總體積各1μL，濃度20～30ng/μL提取的模板DNA 2μL、ddH₂O 6μL；

PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃45second，55-60℃45second，72℃30second，35個(gè)循環(huán)；72℃7min；10℃保存；

(4)電泳檢測(cè)：將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物點(diǎn)樣7μL于加入核酸染料的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，瓊脂糖凝膠的體積百分比濃度為2.5％，電泳緩沖液為1×TAE，電壓90v，電流300mA，功率100W，電泳5h，拍照，分析結(jié)果；

選用7對(duì)InDel標(biāo)記引物對(duì)香菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)照DNA分子量對(duì)照D2000bpDNA ladder可確定各InDel標(biāo)記引物擴(kuò)增的等位片段的數(shù)量和相對(duì)分子量，找到符合編號(hào)組合為：1211(1+2)(1+2)1的菌種，即可確定該菌種為香菇N7菌種；

其中7對(duì)InDel標(biāo)記引物序列(5′-3′)如下：

Lefp_id001正向引物：ACGGATGGAGAGACACAGGA

反向引物：TGCCCCACTTACTCTCAACC

Lefp_id002正向引物：CCTTTCTCAAAAGCGGACTG

反向引物：GGGAGTGGGTTGTTTGGATA

Lefp_id003正向引物：CGGATGTTATGCACTGGAAG

反向引物：CGTACGGTTGGACATTTGAA

Lefp_id004正向引物：AGCCTTTCACAGTCAGCTCG

反向引物：GTCAACGGAGGGAAACAGAG

Lefp_id005正向引物：GTAGCACTCCTCATACAACC

反向引物：ACCAAATGTCACAGCACAGG

Lefp_id006正向引物：ACATTGGCGAAGGCTGTACG

反向引物：CCCTTTTGCCCTATAAGGCG

Lefp_id007正向引物：AACAGTAACCTGTGCACTGC

反向引物：CATGATCAGATCACACAGCG。