[發(fā)明專利]能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒、病毒樣顆粒及其制備方法

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• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112626126A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 鄭航輝;方倪冉;陳杏桃;董楠;楊小云
• 申請（專利權(quán)）人: 華農(nóng)（肇慶）生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/01;C07K14/08;C12P21/02;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市科豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 龔元元

1.一種能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：擴增雞傳染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因后與pFastBac 1載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中，篩選陽性克隆獲得重組質(zhì)粒pFastBac 1-VP2，將測序正確的pFastBac 1-VP2轉(zhuǎn)入DH10 Bac感受態(tài)中獲得重組質(zhì)粒Bacmid-IBDV-VP2；

步驟2：將Bacmid-IBDV-VP2轉(zhuǎn)入SF9細胞，收獲重組桿狀病毒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟1中，雞傳染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因通過以下方法獲?。?/p>

雞傳染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)使用RNA抽提試劑盒提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA；

采用引物對cDNA進行PCR擴增得到擴增產(chǎn)物VP2基因，擴增體系為：50μL，其中，10×PCRBuffer 5μL,dNTPlμL，上、下游引物各lμL，cDNAlμL，pfu酶lμL，ddH2O40μL；dNTP中各類堿基的濃度為l0mM；上、下游引物的濃度均為l0mM；

PCR反應參數(shù)：95℃5min；94℃30s,57℃30s,72℃120s,30個循環(huán)；72℃10min；

上下游引物的序列分別為：

VP2—F:CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAA

VP2—R:CCCAAGCTTGAAGCCGAATGCTCCTGCAAT；

使用膠回收試劑盒將VP2基因進行回收。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，VP2基因與pFastBac 1載體連接的方法為：

分別將膠回收后的VP2基因和pFastBac 1載體使用BamH I和Hind I I I雙酶切，分別回收、純化，將酶切后的VP2基因片段和pFastBac 1載體用T4連接酶16℃過夜連接。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟2具體為：

取無血清懸浮培養(yǎng)的Sf9細胞，在搖瓶中懸浮轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒Bacmid-IBDV-VP2混勻后，加入Sf9細胞懸液中在搖床中培養(yǎng)，當細胞活率降至60％時收獲培養(yǎng)上清，即為P0代桿狀病毒，對P0代桿狀病毒進行擴增1-2次使其滴度超過10⁸TCID50。

5.一種能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒，其特征在于，采用如權(quán)利要求1-4任一所述的方法制備得到。

6.一種能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，采用細胞生物反應器對Sf9細胞進行全懸浮無血清培養(yǎng)，當細胞密度培養(yǎng)至5×10⁶-6×10⁶cells/ml，利用權(quán)利要求1-4任一所述的重組桿狀病毒進行感染，全懸浮無血清培養(yǎng)5-7天，表達蛋白可形成病毒樣顆粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒，其特征在于，所述重組桿狀病毒的滴度不低于10⁸TCID50。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，采用細胞生物反應器對Sf9細胞進行全懸浮無血清培養(yǎng)的參數(shù)為：

轉(zhuǎn)速：120rpm；pH值：6.10±0.1；壓縮空氣通氣量15ccm；氧氣通氣量30ccm；溶氧量50％；溫度27℃。