[發明專利]能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒、病毒樣顆粒及其制備方法

在審

• 申請號: 202011567730.1
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112626126A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 鄭航輝;方倪冉;陳杏桃;董楠;楊小云
• 申請（專利權）人: 華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/01;C07K14/08;C12P21/02;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 龔元元

本發明屬于生物領域，公開了一種能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒的制備方法，包括如下步驟：步驟1：擴增雞傳染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因后與pFastBac 1載體連接，連接產物轉入DH5α感受態中，篩選陽性克隆獲得重組質粒pFastBac 1?VP2，將測序正確的pFastBac 1?VP2轉入DH10 Bac感受態中獲得重組質粒Bacmid?IBDV?VP2；步驟2：將Bacmid?IBDV?VP2轉入SF9細胞，收獲重組桿狀病毒。本發明采用雞傳染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)作為VP2基因的來源病毒株，其能表現出更好的免疫效果。同時，本發明還提供一種病毒樣顆粒極其制備方法，其優勢在于：適于規模化生產、效價高、產物無需濃縮、純化等工藝，節約成本，流程簡單且安全。

技術領域

本發明涉及生物領域，具體涉及一種能夠表達禽法氏囊病病毒樣顆粒的重組桿狀病毒、病毒樣顆粒及其制備方法。

背景技術

傳統動物疫苗以全病毒滅活疫苗和弱毒疫苗為主，其生產必須依賴動物細胞、雞胚、活體動物等基質，在產量上存在較大局限性，需要較高的成本，且培育過程易引入外源病毒，導致疫苗污染。此外，天然弱毒疫苗存在毒力返強風險，生物安全問題時刻存在。隨著分子生物學的發展，高新技術疫苗已成為研究的前沿領域，以分子生物學技術的基本方法研究開發獸用新型疫苗是21世紀的主導方向。重組亞單位疫苗是用基因工程DNA重組技術將保護性抗原基因在原核或真核細胞中表達基因產物——蛋白質或多肽制成的疫苗，與傳統疫苗相比較具有安全性高、純度高，穩定性好以及產量高等優點，該類疫苗是目前使用最廣泛的新型疫苗。以大腸桿菌生產亞單位疫苗較為常見，但依舊存在不足之處：由于其革蘭氏陰性菌的特性，內毒素問題長期存在；表達的蛋白缺乏糖基化、磷酸化修飾，大大降低生物學活性，以上問題均對疫苗質量產生影響，生產上需找到新的替代菌種。

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一種由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease Virus,IBDV)感染引起的雞急性、高度接觸性傳染病，是我國規定要嚴格防控的II類動物疫病。IBDV主要侵害雛雞體液免疫器官法氏囊，損傷淋巴細胞，從而導致雞的免疫機能障礙，進而增加對其他病原的易感件，甚至造成對其他疫苗的免疫應答能力下降。感染IBDV后，雛雞群在短時間內大量死亡或雞群產肉、產蛋等生產性能大幅度下降，帶來直接經濟損失。由于IBDV超強毒株的出現及環境因素、免疫程序等諸多因素的影響，雞IBD在我國發病情況呈現新趨勢：流行面積日益擴大、發病雞群日齡變寬、伴隨嚴重繼發感染和并發癥等。

除了嚴格的環境衛生制度外，疫苗的使用仍然是目前雞IBD的主要防控手段，生產中應用最廣泛的IBDV疫苗種類是滅活疫苗和弱毒疫苗。接種雞胚后收獲尿囊液是上述兩類疫苗的傳統生產方式，現也有使用雞胚成纖維細胞(CEF)生產弱毒疫苗，但無論是使用雞胚或是CEF,都存在SPF雞胚消耗大、單位材料生產力低、生產周期長、總體生產成本高等天然問題。傳統生產工藝的缺陷對IBDV疫苗的應用產生了一定的限制，不符合現階段養禽業疫病防控、健康發展的需求，因此，迫切需要一種低成本、大規模、高效的IBDV疫苗生產方式適應行業的生產。

桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統是近年來應用最多的表達系統。目前常被使用的Bac-to-Bac表達系統。轉座后的重組桿狀病毒載體質粒可在大腸桿菌和昆蟲細胞內復制。該表達系統具有PPH和PP10兩個超強的轉錄啟動子，轉錄后期可高效表達外源蛋白，最高可達到細胞總蛋白表達量的50％。此表達系統最常用的細胞系主要為草地貪夜蛾卵巢(SF9、SF21細胞)和粉紋夜蛾卵巢(High Five細胞)。兩種細胞均可用無血清培養基培養，避免支原體污染。

亞單位疫苗的應用已經成為畜牧行業的趨勢，建立亞單位疫苗生產體系勢在必行，桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統具有突出的優勢。本發明核心在于通過桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統來表達禽法氏囊病病毒樣顆粒，為大批量蛋白疫苗的生產提供可靠理論基礎和技術支撐。