[發明專利]一種香菇CV501菌株的InDel標記指紋圖譜及其構建方法

在審

• 申請號: 202011567142.8
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112725492A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 沈秀芬;于海龍;章爐軍;譚琦;尚曉冬;翟丹丹;李巧珍;張丹;劉建雨
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務所(普通合伙) 31287
• 代理人: 張竹梅

1.一種香菇CV501菌種的InDel標記指紋圖譜的構建方法，包括：

(1)菌絲培養：將香菇菌絲轉接到PDA平板上，25℃下避光培養，10d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提取：用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度為20～30ng/uL；CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：

①取冷凍干燥后的香菇菌絲于2mL離心管中，并放入2-3顆鋼珠；

②將離心管放入多樣品組織研磨機中，設置頻率60Hz，時間30s研磨至均勻粉末；

③加入65℃預熱1h的2×CTAB抽提液，于65℃保溫60min，間隔20min輕搖混勻一次；

④12000rpm、4℃離心20min，分裝上清液，分裝為兩管各800μL；

⑤在上述上清液中加入體積比為25：24：1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入新的離心管中；

⑥在上述離心管中加入體積比為24：1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；

⑦在上述離心管中加入相對于步驟⑥中上清液2/3體積的-20℃預冷的異丙醇，混勻，-20℃下靜置沉淀1h，之后8000rpm、4℃離心10min，棄上清；

⑧將得到的沉淀加入1mL濃度為70％乙醇洗滌1次，8000rpm，室溫離心5min；

⑨棄乙醇，超凈工作臺中吹干；加入100μL 10×TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩將得到的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用；

(3)InDel分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行開發的InDel標記的PCR擴增；

PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：Premix Taq^TM(1.25U/25μL Taq DNA酶，0.4mM/LdNTP，0.3mM/L PCR buffer)10uL，10μmol/L InDel標記正向引物和反向引物總體積各1μL，濃度20～30ng/μL提取的模板DNA2μL、ddH₂O 6μL；

PCR反應條件：94℃ 5min；94℃ 45second，55-60℃ 45second，72℃ 30second，35個循環；72℃ 7min；10℃保存；

(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物點樣7μL于加入核酸染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，瓊脂糖凝膠的體積百分比濃度為2.5％，電泳緩沖液為1×TAE，電壓90v，電流300mA，功率100W，電泳5h，拍照，分析結果；

選用7對InDel標記引物對香菇菌株進行PCR擴增，通過對照DNA分子量對照D2000 bpDNA ladder可確定各InDel標記引物擴增的等位片段的數量和相對分子量，找到符合編號組合為：(1+2)012212的菌種，即可確定該菌種為香菇CV501菌種；

其中7對InDel標記引物序列(5′-3′)如下：

Lefp_id001正向引物：ACGGATGGAGAGACACAGGA

反向引物：TGCCCCACTTACTCTCAACC

Lefp_id002正向引物：CCTTTCTCAAAAGCGGACTG

反向引物：GGGAGTGGGTTGTTTGGATA

Lefp_id003正向引物：CGGATGTTATGCACTGGAAG

反向引物：CGTACGGTTGGACATTTGAA

Lefp_id004正向引物：AGCCTTTCACAGTCAGCTCG

反向引物：GTCAACGGAGGGAAACAGAG

Lefp_id005正向引物：GTAGCACTCCTCATACAACC

反向引物：ACCAAATGTCACAGCACAGG

Lefp_id006正向引物：ACATTGGCGAAGGCTGTACG

反向引物：CCCTTTTGCCCTATAAGGCG

Lefp_id007正向引物：AACAGTAACCTGTGCACTGC

反向引物：CATGATCAGATCACACAGCG。