[發(fā)明專利]一種檢測(cè)試紙及制備方法與其在檢測(cè)端粒酶活性中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011566182.0
• 申請(qǐng)日: 2020-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN112553304A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐曉文;張瑞雪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6816
• 分類號(hào): C12Q1/6816;C12Q1/48
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 王磊

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)試紙及制備方法與其在檢測(cè)端粒酶活性中的應(yīng)用，包括依次連接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜，所述結(jié)合墊負(fù)載DNA?金納米探針，所述硝酸纖維素膜設(shè)置測(cè)試區(qū)，所述測(cè)試區(qū)內(nèi)固定測(cè)試區(qū)序列；所述DNA?金納米探針包括探針DNA和金納米粒子，探針DNA的一端與金納米粒子連接，所述探針DNA能夠與端粒酶底物DNA雜交；所述測(cè)試區(qū)序列是能夠與端粒酶底物DNA催化延伸的序列進(jìn)行雜交的DNA。本發(fā)明提供的試紙對(duì)端粒酶延伸產(chǎn)物響應(yīng)靈敏迅速，能夠?qū)崿F(xiàn)端粒酶活性的可視化檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)試紙及制備方法與其在檢測(cè)端粒酶活性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

公開該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

端粒酶是由細(xì)胞內(nèi)端粒酶RNA和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶組成的核糖核蛋白，能以自身RNA片段為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，將DNA重復(fù)序列(TTAGGG)_n添加到染色體末端的端粒上。正常體細(xì)胞中的端粒酶活性處于抑制狀態(tài)，隨細(xì)胞分裂端粒逐漸縮短，當(dāng)端粒縮短至臨界長(zhǎng)度時(shí)，細(xì)胞停止分裂，進(jìn)入衰老階段直至凋亡。端粒酶活性的激活導(dǎo)致端粒的持續(xù)延伸，補(bǔ)償端粒自然縮短，維持細(xì)胞復(fù)制循環(huán)中的端粒長(zhǎng)度，從而避開端粒長(zhǎng)度主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，維系細(xì)胞的持續(xù)分裂和長(zhǎng)期存活。幾乎所有種類的原發(fā)性腫瘤細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)活躍，其與癌變發(fā)生和腫瘤細(xì)胞的永生化密切相關(guān)。同時(shí)，端粒酶活性的過度表達(dá)在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中也被檢測(cè)到，表明其能夠指示腫瘤的發(fā)展。于此，端粒酶被認(rèn)為是癌癥診斷和預(yù)后評(píng)估中的重要標(biāo)志物。

基于端粒酶對(duì)端粒酶底物DNA的催化延伸作用，可對(duì)端粒酶進(jìn)行特異性識(shí)別進(jìn)而實(shí)現(xiàn)端粒酶活性的檢測(cè)。早期方法包括底物延伸測(cè)定法⁶和端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法，通過對(duì)端粒酶底物DNA的延伸片段進(jìn)行凝膠電泳表征從而評(píng)估端粒酶活性。為避免其中的放射性/誘變性危害和因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的結(jié)果假象等問題，相繼發(fā)展了電化學(xué)法、熒光法、表面等離子體共振法、表面增強(qiáng)拉曼法等方法。這些方法能夠靈敏、準(zhǔn)確地進(jìn)行端粒酶活性的定量分析，但需要專業(yè)人員依靠?jī)x器測(cè)試完成，提高了對(duì)檢測(cè)人員的要求，特定儀器的使用也不便于方法的推廣。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，比色法雖然能夠在一定程度上減小對(duì)儀器的依賴，但往往需要在有色溶液中觀察另一種顏色的產(chǎn)生，在目標(biāo)物濃度較低時(shí)的微弱顏色變化的限制了其靈敏度的提高；同時(shí)在溶液相中進(jìn)行的顯色反應(yīng)不便于進(jìn)行定點(diǎn)快速分析，顯色結(jié)果亦不適于長(zhǎng)期保存。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)試紙及制備方法與其在檢測(cè)端粒酶活性中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的試紙對(duì)端粒酶延伸產(chǎn)物響應(yīng)靈敏迅速，能夠?qū)崿F(xiàn)端粒酶活性的可視化檢測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一方面，一種檢測(cè)試紙，包括依次連接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜，所述結(jié)合墊負(fù)載DNA-金納米探針，所述硝酸纖維素膜設(shè)置測(cè)試區(qū)，所述測(cè)試區(qū)內(nèi)固定測(cè)試區(qū)序列；

所述DNA-金納米探針包括探針DNA和金納米粒子，探針DNA的一端與金納米粒子連接，所述探針DNA能夠與端粒酶底物DNA雜交；

所述測(cè)試區(qū)序列是能夠與端粒酶底物DNA催化延伸的序列進(jìn)行雜交的DNA。

另一方面，一種上述檢測(cè)試紙的制備方法，包括如下步驟：

提供巰基化的探針DNA，將金納米粒子與巰基化的探針DNA通過孵育連接獲得DNA-金納米探針，向結(jié)合墊噴涂使DNA-金納米探針的溶液；

提供生物素化的測(cè)試區(qū)序列，將生物素化的測(cè)試區(qū)序列與鏈霉親和素孵育制備鏈霉親和素-生物素化的測(cè)試區(qū)序列，將鏈霉親和素-生物素化的測(cè)試區(qū)序列噴涂至硝酸纖維素膜的測(cè)試區(qū)；

將樣品墊、噴涂使DNA-金納米探針的結(jié)合墊、噴涂鏈霉親和素-生物素化的測(cè)試區(qū)序列的硝酸纖維素膜依次連接獲得。