[發明專利]一種桿狀病毒表達系統制備牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的方法及應用

有效

• 申請號: 202011565641.3
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112646840B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發明（設計）人: 陳創夫;何金科;鄧肖玉;王勇;何延華
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C07K14/18;G01N33/569;G01N33/68;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于獸用生物制品技術領域，尤其涉及一種桿狀病毒表達系統制備牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的方法及應用。將BVDV?LC株E2基因連接至pFastBac1重組桿狀病毒轉移載體，在大腸桿菌中通過同源重組獲得重組桿狀病毒載體rBacmid?E2，轉染Sf9昆蟲細胞后獲得第一代重組桿狀病毒P1，將P1代病毒繼續感染Sf9昆蟲細胞獲得感染能力高的第二代重組桿狀病毒P2，再將P2代病毒擴大培養后純化得到E2蛋白。將本發明制備的E2蛋白作為診斷抗原和亞單位疫苗，能夠表現出更好的優勢，可以作為候選抗原進行疫苗和ELISA試劑盒的開發。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域，尤其涉及一種桿狀病毒表達系統制備牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的方法及應用。

背景技術

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)由牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起的一種復雜的，多臨床類型的疾病。該病主要以發熱、腹瀉、粘膜糜爛潰瘍、白細胞減少、免疫耐受與持續感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、懷孕母牛流產、產死胎或畸形胎為主要特征的一種接觸性傳染病。我國畜牧業迅速發展的同時，養殖規模和養殖數量在急劇增加，跨地區的貿易也越來越頻繁，導致牛、羊發病率不斷提高。其中牛病毒性腹瀉黏膜病對牛健康和生產危害較大，給養牛業造成了嚴重的經濟損失。目前，防治該病最有效的方法是篩除病牛并對其余牛進行疫苗接種，但常見的商品化疫苗多為滅活苗，需要多次免疫(一免后一個月需要二次免疫)，保護期短(二免后只能保護4個月)、價格昂貴、不能區分自然感染和疫苗免疫。而且，該疾病商品化的診斷試劑盒來自于美國IDEXX公司，價格昂貴，因而不能滿足防治BVDV的要求。

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統由于具有適當的翻譯后修飾，而且具有生物安全性等優點，已被廣泛用于疫苗和診斷的開發和生產中。目前已有多種桿狀病毒-昆蟲細胞系統生產的疫苗被投入使用，如人乳頭瘤病毒疫苗、人細小病毒HPVB19、豬圓環病毒疫苗、豬瘟病毒E2蛋白疫苗等等。BVDV具有4個結構蛋白，其中E^rns和E2是主要的保護性抗原，能夠誘導病毒中和抗體并保護牛免受BVDV攻擊，而E^rns蛋白具有獨特的RNase活性，可降解單鏈和雙鏈RNA，對于限制宿主對雙鏈RNA的先天免疫反應至關重要，幫助BVDV逃避先天免疫在其宿主中建立持續感染。

本發明選用E2蛋白，利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統在昆蟲細胞內組裝成具有良好反應原性的蛋白，進一步地研究該蛋白在疫苗和診斷方面的應用。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種桿狀病毒表達系統制備牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的方法及應用，目的在于解決現有技術中的一部分問題或至少緩解現有技術中的一部分問題。

本發明是這樣實現的，一種桿狀病毒表達系統制備牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的方法，包括以下步驟：

將BVDV-LC E2基因序列前端添加His標簽后，連接至pFastBac1質粒，得到重組轉移載體；

將重組轉移載體轉化至E.coli DH10Bac^TM中，得到重組桿粒；

用重組桿粒轉染Sf9昆蟲細胞收獲P1代重組桿狀病毒；

將P1代病毒繼續感染Sf9昆蟲細胞獲得感染能力高的第二代重組桿狀病毒P2；

再將P2代病毒擴大培養后純化得到E2蛋白。

進一步地，所述BVDV-LC E2基因序列見SEQ ID NO.1所示。

進一步地，通過同源重組的方法將重組轉移載體轉化至E.coli DH10Bac^TM中。

進一步地，Sf9昆蟲細胞的培養條件為27℃。

本發明還披露了利用上述的方法制備的牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白。