[發明專利]一種慢病毒生產方法

在審

• 申請號: 202011565496.9
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN114686447A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 蔡麗娥;王慶強;王秀秀;吳飛;唐小麗;韓芳婷
• 申請（專利權）人: 上海吉凱基因醫學科技股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種慢病毒生產方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1)將含有慢病毒載體基因組序列的載體與具有季銨鹽結構的聚陽離子類轉染試劑混合形成轉染液，二者混合的質量體積比為1:2.5～1:3.5，單位為μg:μl；

2)將上述轉染液加入培養的細胞中，繼續培養；

3)收取細胞培養上清液，即為含慢病毒的培養液。

2.根據權利要求1所述的慢病毒生產方法，其特征在于，慢病毒的基因組序列分布于輔助質粒和穿梭質粒上。

3.根據權利要求1所述的慢病毒生產方法，其特征在于，所述具有季銨鹽結構的聚陽離子類轉染試劑選自脂質聚酰胺或聚氨基酰胺；優選的，所述聚氨基酰胺選自Zymofect293。

4.根據權利要求1所述的慢病毒生產方法，其特征在于，步驟1)還包括以下特征中的一項或多項：

1)所述輔助質粒為H1質粒和H2質粒，所述H1質粒：H2質粒：穿梭質粒的質量比為2.5:1:5～3:1:4；

2)所述輔助質粒、穿梭質粒的總質量為15～20μg/10cm培養皿；

3)所述具有季銨鹽結構的聚陽離子類轉染試劑的用量為37.5～70μl/10cm培養皿。

5.根據權利要求1所述的慢病毒生產方法，其特征在于，所述步驟2)還包括：將轉染液在室溫放置5～25分鐘后再加入培養的細胞中；和/或，所述培養細胞選自HEK293T。

6.根據權利要求1所述的慢病毒生產方法，其特征在于，所述方法還包括將步驟3)獲得的細胞培養上清液進行濃縮純化。

7.根據權利要求6所述的慢病毒生產方法，其特征在于，所述方法還包括在慢病毒濃縮純化之前進行前處理；優選的，所述前處理選自離心或使用微孔過濾器過濾；更優選的，所述微孔過濾器的孔徑為0.4-0.5μm。

8.根據權利要求6所述的慢病毒生產方法，其特征在于，所述濃縮純化方法選自PEG濃縮純化法。

9.根據權利要求8所述的慢病毒生產方法，其特征在于，所述PEG濃縮純化法包括以下步驟：

1)將PEG與細胞培養上清液混合，以混合液的總體積為基準，所述PEG的終體積濃度為60～100mg/ml；

2)將步驟1)的混合液離心，棄上清，重懸病毒；

3)將重懸的病毒3000～7000rpm離心；取上清過濾，濾液即為濃縮純化的病毒。

10.根據權利要求8所述的慢病毒生產方法，其特征在于，所述PEG沉淀離心法還包括以下特征中的一項或幾項：

1)所述PEG選自PEG8000；

2)將PEG與細胞培養上清液混合后在0～5℃和/或70-100rpm的搖床上混勻10～20小時；

3)步驟2)中離心條件為8000～12000rpm、1.5～2.5小時；

4)步驟2)中重懸病毒時，將病毒重懸液置于0～5℃和/或70-100rpm的搖床上；

5)步驟2)、步驟3)中的離心溫度為0～5℃；

6)步驟3)中的離心時間為3～7分鐘；

7)步驟3)中的過濾為使用0.22μm的微孔過濾器過濾。