[發明專利]一種腦脊液基因測序建庫、檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 202011565077.5
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112538657B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發明（設計）人: 楚玉星;楊玲;王一茜;王珺;吳善旋;洪立梅;李奇
• 申請（專利權）人: 北京吉因加醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6874
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;彭愿潔

一種腦脊液基因測序建庫、檢測方法及其應用，該建庫方法具體是通過對腦脊液的待測樣本進行cfDNA提取，并采用Labchip GX Touch對其進行片段濃度檢測，從而確定構建文庫的PCR循環數，以滿足擴增的需求；再采用濃度至少為20μmol/L的PCR擴增引物濃度進行富集擴增，以提高建庫成功率。

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，具體涉及一種腦脊液基因測序建庫、檢測方法及其應用。

背景技術

腦脊液主要分布于腦室、蛛網膜下腔和脊椎，并在三者之間呈一定方向流動，最終被蛛網膜粒吸收入血。血液-腦脊液之間上皮細胞間的緊密結合及星形細胞形成的膠質界膜構成腦脊液與血液之間的濾過性屏障，稱為血液-腦脊液屏障。大部分中樞神經系統腫瘤直接與腦脊液接觸，釋放ctDNA進入腦脊液，而由于血液-腦脊液屏障的濾過作用，導致ctDNA無法入血，血漿cfDNA可能出現假陰性。因此對于中樞神經系統疾病而言，對腦脊液進行ctDNA（檢測cfDNA里的ctDNA（循環腫瘤DNA））的檢測，能比血漿ctDNA檢測更為真實的反映中樞神經系統疾病情況。

在液態活檢中檢測游離cfDNA時，由于有效數據比例低，因此需要提高起始DNA量和測序數據量。對于樣本量稀少的腦脊液而言，分離后的上清中所提取到的核酸量大多低于檢測下限，導致無法正常建庫，且樣本建庫后出庫濃度低，無法保證低頻被檢出。

發明內容

本發明要解決的技術問題之一是提供一種腦脊液基因測序建庫方法，該方法建庫時間短，成本低，可應用于液態活檢。本發明要解決的技術問題之二是提供一種用上述建庫方法制備的DNA測序文庫對腦脊液基因進行測序檢測的方法，該方法可應用于微量待測樣本的液態活檢。本發明要解決的技術問題之三是提供一種腦脊液基因測序檢測試劑盒，該試劑盒包含有用上述建庫方法制備的DNA測序文庫。本發明要解決的技術問題之四是提供上述構建方法或試劑盒在腦脊液基因組液態活檢中的應用。

根據第一方面，提供一種腦脊液基因測序建庫方法，通過對腦脊液的待測樣本進行cfDNA提取，并采用Labchip GX Touch對其進行質控，從而確定構建文庫的PCR循環數，以滿足擴增的需求。再采用濃度至少為20μmol/L的PCR擴增引物濃度進行富集擴增，以提高建庫成功率。

具體而言，本申請所述腦脊液基因測序建庫方法包括以下步驟：

A、提取、質控：對腦脊液的待測樣本進行至少兩次離心，從上清液中提取待測樣本的cfDNA，采用Labchip GX Touch對所述cfDNA進行片段濃度檢測；

B、構建文庫：對所述cfDNA進行末段修復加A，接頭連接及純化，然后對純化產物進行PCR擴增，并且，根據所述cfDNA的片段濃度檢測結果確定PCR擴增的循環數，對PCR擴增產物進行純化，即得腦脊液cfDNA的基因測序文庫。

腦脊液提取濃度使用Qubit 3.0定量總是遠低于檢測下限，無法進行準確定量。因此本申請采用Labchip GX Touch（取2μL樣本稀釋至20μL）進行片段質控，檢測80-400bp片段（cfDNA所在的片段區間）質量濃度。質量濃度大于0.1ng/μL，cfDNA總量大于5ng時質控結果正常，待測樣本可用于后續檢測。

一種實施例中，所述片段質控是指對片段為80-400bp的cfDNA的質量濃度進行檢測。

根據所述cfDNA的片段濃度檢測結果確定PCR擴增的循環數，具體包括：cfDNA的片段的質量濃度＜0.2ng/μL為風險建庫，PCR循環數為12循環；cfDNA的片段的質量濃度≥0.2ng/μL為正常建庫，PCR循環數為8循環。