[發(fā)明專利]一種多發(fā)性骨髓瘤合并慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011561662.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112514853B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翁建宇;陳曉梅;杜欣;賴沛龍;王玉連;耿素霞;黃欣;曾令基
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): A01K67/027
• 分類號(hào): A01K67/027;C12N15/867;C12N5/10;C12N5/09
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 劉菁菁

1.一種小鼠多發(fā)性骨髓瘤合并cGVHD模型的建立方法，依次包括以下步驟：

(1)以NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠作為模型小鼠；

(2)NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠接受全身輻照100cGy后，將多發(fā)性骨髓瘤熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞株IM-9懸液注射至NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠；

(3)NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠接受注射后8天，將CS1CAR-T細(xì)胞懸液通過(guò)尾靜脈注射至NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠體內(nèi)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠為8-10周齡小鼠。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，多發(fā)性骨髓瘤熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞株IM-9懸液的制備為：24孔板內(nèi)每孔準(zhǔn)備1×10⁶IM-9細(xì)胞，加入攜帶Luciferase的慢病毒，感染12h后換液，3天后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因底物檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株內(nèi)熒光素酶的活性，將穩(wěn)轉(zhuǎn)后的細(xì)胞株計(jì)數(shù)并用RPMI-1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至2.5×10⁶/mL細(xì)胞濃度備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：攜帶Luciferase的慢病毒的MOI值為30。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠在接受直線加速器100cGy單次全身照射預(yù)處理后立即補(bǔ)充飲水，休息4-6小時(shí)后經(jīng)尾靜脈注射終體積為0.4mL的多發(fā)性骨髓瘤熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞株IM-9懸液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)中，CS1 CAR-T細(xì)胞懸液的制備為：正常人外周血先經(jīng)過(guò)Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，分選出CD3+T細(xì)胞，將分選得到的T細(xì)胞離心，并用PBS洗一次，計(jì)數(shù)，用T細(xì)胞培養(yǎng)基重懸為1×10⁶/mL，種在24孔板內(nèi)，1mL每孔，用human T-Activator CD3/CD28Dynabeads刺激72h,經(jīng)72h刺激后，收集T細(xì)胞離心，計(jì)數(shù)重懸于T細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入攜帶抗CS1抗原的scFv慢病毒，感染12h后換液，72h檢測(cè)GFP％確定轉(zhuǎn)染效率，將CAR-T密度維持在1×10⁶/mL左右，每2-3天進(jìn)行一次半量換液,兩周后，CAR-T細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增至足夠數(shù)量,GFP陽(yáng)性的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，將CS1 CAR-T細(xì)胞計(jì)數(shù)并用RPMI-1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至12.5×10⁶/mL細(xì)胞濃度備用。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)中，注射給NOD-SCID-IL2rg-/-小鼠的CS1CAR-T細(xì)胞的用量為5×10⁶。