[發(fā)明專利]一種重組人干擾素-κ包涵體的純化和復(fù)性方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011560333.1
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112694527B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭繼先;李振森;晁香君;吳桂蘋;韓景花
• 申請（專利權(quán)）人: 山東睿鷹制藥集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C07K14/555
• 分類號: C07K14/555;C12N15/20;C12N1/21;C07K1/18;C07K1/14;C12N15/70;C12N15/66;A61K38/21;A61P31/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京中知星原知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11868
• 代理人: 艾變開

本發(fā)明公開了一種重組人干擾素?κ包涵體的純化和復(fù)性方法。所述方法包括：將人干擾素kappa(hIFN?κ)的編碼基因通過密碼子優(yōu)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建基因工程菌，所構(gòu)建的基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)，以包涵體的方式高效表達(dá)重組人干擾素hIFN?κ，經(jīng)過純化復(fù)性，獲得高純度的具有抗病毒活性的hIFN?κ。本發(fā)明的純化及復(fù)性方法實(shí)現(xiàn)了88％以上的包涵體純度和60％以上的hIFN?κ蛋白收率，操作簡單且適于大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組人干擾素-κ包涵體的柱層析復(fù)性方法。

背景技術(shù)

干擾素(Interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，其可以通過結(jié)合靶細(xì)胞上的同源受體復(fù)合物而發(fā)揮抗病毒的活性。其中，I型干擾素家族的多位成員，作為抗病毒藥物候選，已經(jīng)完成臨床的藥物試驗(yàn)，如重組IFN-α2被應(yīng)用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的治療藥物，IFN-β被應(yīng)用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)。對重癥急性呼吸綜合征急性期患者聯(lián)合使用激素與IFN-α治療，可縮短患者的住院時(shí)間，促進(jìn)肺部病變的吸收，減少對激素的需求量，但不會縮短發(fā)熱持續(xù)時(shí)間，而且IFN-α治療可能與機(jī)體持續(xù)的炎癥反應(yīng)相關(guān)，不利于患者的恢復(fù)。

干擾素卡帕(Interferon-κ，IFN-κ)是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的IFN成員，IFN-κ由207個氨基酸殘基組成，包括N端27個氨基酸殘基的信號肽，與Ⅰ型IFN的其他成員有約30％的同源性，IFN-員比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋間有12個氨基酸殘基的插入。IFN-κ與IFN-α、IFN-β共同使用一個受體蛋白，屬于I型干擾素。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)編碼IFN-κ的基因選擇性地在上皮角蛋白細(xì)胞中表達(dá)，重組hIFN-κ與其他同型的干擾素類似，可以保護(hù)細(xì)胞免于病毒的感染；且所述表達(dá)具有種族的特異性。

IFN-κ能夠活化干擾素刺激基因，抑制腦心肌炎病毒(ECMV)和人類乳頭瘤病毒(HPV)的復(fù)制。IFN-κ是一種相對溫和的I型干擾素，能有效抑制囊膜病毒的復(fù)制，是構(gòu)成性表達(dá)的干擾素成員之一，組成抗病毒的天然免疫屏障，呼吸道給藥無明顯毒性，能夠有效抑制流感病毒PR8、H9N2和H7N9以及寨卡病毒的復(fù)制，在降低病毒致病性中發(fā)揮重要保護(hù)作用，與IFN-α相似，其作用機(jī)制主要是通過上調(diào)干擾素刺激基因以抑制病毒復(fù)制。

目前，對于IFN-κ蛋白的研究相對較少，且從人體中獲得IFN-κ蛋白的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足科研或臨床應(yīng)用的要求。因此，如何獲得高純度和高收率的IFN-κ蛋白是當(dāng)前迫切需要解決的問題。在現(xiàn)有技術(shù)中，利用大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因，形成包涵體，然后對包涵體復(fù)性是一種常用的方法。然而，包涵體蛋白的復(fù)性是當(dāng)前一個重要的難題。傳統(tǒng)的復(fù)性方法采用稀釋、透析等常規(guī)操作，或者采用低濃度變性劑(鹽酸胍或者尿素)洗滌，造成了洗滌過程中包涵體損失較大，產(chǎn)生大量廢水，耗時(shí)耗能，且IFN-κ蛋白的活性和收率都不高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。

因此，針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的IFN-κ蛋白復(fù)性過程存在的問題，提出了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新的重組人干擾素-κ包涵體的復(fù)性方法，其通過采用含有密碼子優(yōu)化的序列的基因工程菌株，將包涵體的溶解、純化和復(fù)性步驟有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了高的包涵體純度和目標(biāo)蛋白收率，且包涵體復(fù)性后獲得具有優(yōu)異的抗病毒活性的hIFN-κ。

本發(fā)明的目的通過包括以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：