[發(fā)明專(zhuān)利]一種重組人干擾素-κ包涵體的純化和復(fù)性方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011560333.1
• 申請(qǐng)日: 2020-12-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112694527B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭繼先;李振森;晁香君;吳桂蘋(píng);韓景花
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東睿鷹制藥集團(tuán)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/555
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/555;C12N15/20;C12N1/21;C07K1/18;C07K1/14;C12N15/70;C12N15/66;A61K38/21;A61P31/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京中知星原知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11868
• 代理人: 艾變開(kāi)

1.一種重組人干擾素kappa(hIFN-κ)包涵體的純化和復(fù)性方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

a)包涵體的獲得：培養(yǎng)宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體、重懸緩沖液重懸、破碎細(xì)胞后離心收集沉淀；所述重懸緩沖液為10-50mM Tris，200-500mM NaCl，PH 8.0-8.5；

步驟b)中使用的b)包涵體的洗滌：利用洗滌緩沖液重懸沉淀，均質(zhì)2~3次，離心收集洗滌后的包涵體；所述洗滌緩沖液為：5-20mM Tris，0.02-0.05M NaCl，0.5-2mM EDTA，0.5-2%TritionX-100，pH 8.0-8.5；

c)包涵體的純化：利用變性緩沖液溶解步驟b)獲得的包涵體，離子交換層析得到包含純化包涵體的洗脫液，所述離心層析具體是：將溶解后的包涵體進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析得到陽(yáng)離子交換層析產(chǎn)物，將所述陽(yáng)離子交換層析產(chǎn)物進(jìn)行陰離子交換層析得到陰離子交換層析產(chǎn)物，其中變性緩沖液為：10-50mM Tris，6-10M尿素，50-150mM NaCl，1-2mM EDTA，1-10mM二硫蘇糖醇或巰基乙醇，pH 8.0-10.5；洗脫緩沖液為：10-50mM Tris，6-10M尿素，500-1000mM NaCl，1-2mM EDTA，1-10mM二硫蘇糖醇或巰基乙醇，pH 8.0-10.5；

d)包涵體的復(fù)性：用變性緩沖液稀釋在步驟c）獲得的純化的包涵體使得所述包涵體中的蛋白濃度為5-10mg/ml，將稀釋后的洗脫液加入復(fù)性緩沖液中，于2-8℃靜置20-72h，從而將步驟c）獲得的包含純化包涵體的洗脫液復(fù)性;

其特征在于，所述步驟a)的包涵體通過(guò)培養(yǎng)含有編碼hIFN-κ的基因的宿主細(xì)胞后，誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)、離心收集菌體、高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞、離心收集獲得；其中，所述編碼hIFN-κ的基因SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;

步驟d)中使用的復(fù)性緩沖液為1-30mM Tris，1-20mM磷酸二氫鈉，20-100mM氯化鈉，0.2-0.6mM氧化型還原劑，0.5-3mM EDTA，0.05-0.2% TritionX-100，PH 7.0-8.5。

2.如權(quán)利要求1所述的純化和復(fù)性方法，其特征在于，在步驟a)中，所述誘導(dǎo)表達(dá)包括在培養(yǎng)溫度35~38℃、轉(zhuǎn)速200~250rpm條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，當(dāng)OD600值達(dá)到0.8時(shí)用IPTG誘導(dǎo)，形成包涵體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化和復(fù)性方法，其中所述IPTG的濃度為0.4-1.2mM。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化和復(fù)性方法，其中，所述IPTG的濃度為0.6-1.0mM。

5.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的純化和復(fù)性方法，其特征在于，所述方法還包括步驟e)活性檢測(cè)，所述活性檢測(cè)包括親和力檢測(cè)。