[發明專利]一種人干擾素-κ突變體及其制備方法

在審

• 申請號: 202011560308.3
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112521480A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 彭繼先;錢文正;柴輝;閆韻秋;戴文宇;李振森;于海勤
• 申請（專利權）人: 山東晶輝生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/555
• 分類號: C07K14/555;C12N15/20;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/21;A61P35/00;A61P31/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京中知星原知識產權代理事務所(普通合伙) 11868
• 代理人: 艾變開

本發明涉及人干擾素?κ(hIFN?κ)突變體及其制備方法。所述的hIFN?κ變體是將hIFN?κ的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第166位游離的半胱氨酸(C)突變為絲氨酸(S)，或者突變為與絲氨酸結構相近的甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。與含有野生型hIFN?κ序列的菌株相比，含有本發明的突變體序列的質粒的菌株表達產生的hIFN?κ產量較高，與干擾素?κ受體結合的親和力更高，體外活性也更好。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及人干擾素-κ的突變體及其制備方法。

背景技術

干擾素(Interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、免疫調節作用的細胞因子。其可以通過結合靶細胞上的同源受體復合物而發揮抗病毒的活性。

干擾素卡帕(Interferon-κ，IFN-κ)是近年來發現的一個新的IFN成員，與IFN-α、IFN-β共同使用一個受體蛋白，屬于I型干擾素。IFN-κ由207個氨基酸殘基組成，包括N端27個氨基酸殘基的信號肽，與Ⅰ型IFN的其他成員有約30％的同源性，IFN-κ比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋間有12個氨基酸殘基的插入。IFN-κ基因位于第9對染色體短臂，與其他Ⅰ型IFN的基因鄰近，其他Ⅰ型IFN基因無內含子，但IFN-κ基因的3′端非編碼區含有1個內含子。目前，有研究發現編碼IFN-κ基因選擇性的在上皮角蛋白細胞中表達，重組的hIFN-κ與其他同型的干擾素類似，可以保護細胞免于病毒的感染；且所述的表達具有種族的特異性。

天然干擾素-κ序列中含有兩對二硫鍵和一個單獨未成對的半胱氨酸。干擾素-κ的體外表達一直是個難題，目前都采用原核表達的方法，但通常都以包涵體形式表達，因而在蛋白質復性過程中蛋白的正確折疊和二硫鍵的正確配對便成了關鍵。另外，在復性過程中，游離半胱氨酸的存在往往對這種正確折疊和配對帶來干擾，同時也使得蛋白在復性過程中形成聚集體而失活。

因此，改善蛋白質復性過程中蛋白的正確折疊和二硫鍵的正確配對，減少干擾素-κ在復性過程的蛋白質聚集，對于提高干擾素-κ蛋白的純度顯得尤為重要。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種干擾素-κ突變體，其與未突變的天然干擾素-κ蛋白相比，在與受體結合親和力和活性方面都具有顯著的改善。

本發明的另一目的在于提供一種制備干擾素-κ突變體的方法，通過培養、誘導表達、收集包涵體、復性、層析等操作，實現了較高的復性效率，且所獲得的蛋白具有更高的活性。

本發明的目的通過包括以下的本申請的技術方案來實現：

根據本發明的一個方面，提供一種人干擾素kappa(hIFN-κ)突變體。

在所述突變體中，天然hIFN-κ的氨基酸序列中第166位的半胱氨酸突變為不能形成二硫鍵的氨基酸殘基，其中所述突變體可以消除蛋白表達純化過程中包涵體的復性過程中對于正確折疊的影響。

在所述hIFN-κ突變體中，1)天然存在的hIFN–κ的對應于SEQ ID NO:1中第166位置上的半胱氨酸替換為20種天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19種氨基酸中的任一種，優選為絲氨酸；或，2)來源于人且與SEQ ID NO:1具有99％同源性的氨基酸序列的對應于SEQID NO:1的第166位的半胱氨酸替換為20種天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19種氨基酸中的任一種，優選為絲氨酸；或，3)所述hIFN-κ突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本發明中，所述20種天然氨基酸為本領域已知的20種天然氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸。

根據本發明的第二方面，提供一種編碼所述hIFN-κ突變體的核酸分子，其中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。