[發明專利]本氏煙NbSMG7基因在調控植物抗病毒中的應用及轉基因植物培育方法

有效

• 申請號: 202011557572.1
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112538488B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 李方方;陳雅琳;周雪平
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

1.本氏煙NbSMG7基因在調控植物抗病毒中的應用，其特征在于：所述病毒為黃瓜綠斑駁花葉病毒；所述NbSMG7的轉錄本序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根據權利要求1所述的本氏煙NbSMG7基因在調控植物抗病毒中的應用，其特征在于：通過克隆本氏煙中NbSMG7基因，將其構建為帶有熒光標簽的YFP-NbSMG7載體，將YFP-NbSMG7載體轉入農桿菌后侵染煙草進行煙草的遺傳轉化，獲得的本氏煙過表達YFP-NbSMG7植物能夠顯著阻礙黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染。

3.一種抗黃瓜綠斑駁花葉病毒的NbSMG7轉基因植物的培育方法，其特征在于：通過農桿菌轉化的方法，將NbSMG7基因導入目的植物中，獲得本氏煙NbSMG7高表達的轉基因植物；所述NbSMG7的轉錄本序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根據權利要求3所述的NbSMG7轉基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）獲得本氏煙植株，用Trizol法從本氏煙植株葉片中提取RNA，去除RNA樣品中基因組DNA，并反轉錄得到cDNA；

（2）利用引物對NbSMG7-F和NbSMG7-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA為模板進行PCR擴增，所使用的引物序列為：

NbSMG7-F：atgatgaccattccaatgga，

NbSMG7-R：cacaaacaaacggccttc；

（3）將擴增產物構建到n-YFP載體上，獲得YFP-NbSMG7重組質粒；

（4）將1 μl重組質粒與100 μl農桿菌感受態混合轉入電擊杯中，使用電擊裝置2500 V電擊轉化，加入LB培養基培養2小時恢復后涂布到抗性培養基上篩選獲得帶有YFP- NbSMG7重組質粒的農桿菌；

（5）將帶有重組質粒的農桿菌侵染煙草葉片，經分化培養獲得愈傷組織，再經生根培養獲得小苗，轉移繼續培養；

（6）繼續培養的小苗生長穩定后，取葉片樣品，用CTAB法從植物葉片中提取DNA，以提取DNA為模板進行PCR擴增，確定YFP-NbSMG7是否轉化成功；所使用的引物序列為：

35S-F：cgcaagacccttcctctatataaggaa，

NbSMG7-R：CACAAACAAACGGCCTTC；如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，

以上樣品抽提總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，再使用GFP抗體進行Western blot確定植物表達了帶YFP熒光標簽的YFP-NbSMG7；對轉化成功的過表達YFP-NbSMG7轉基因煙草留種。