[發明專利]一種同步檢測六種霉菌毒素的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202011556600.8
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN114660294B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 陳義強;金永鵬;劉穎;張婉君
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/53
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

1.一種同步檢測六種霉菌毒素的試劑盒，所述六種霉菌毒素分別為：黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏馬毒素B₁和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；其特征在于，含有檢測試紙條和檢測試劑；所述檢測試紙條為側流免疫層析檢測試紙條，包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和襯板；所述硝酸纖維素膜上設置6條檢測線和1條質控線，每條檢測線上包被1種抗原；所述檢測試劑為所述六種霉菌毒素的單抗分別與納米金結合的納米金-抗體復合物的混合溶液；

6條檢測線上包被的抗原分別為：AFM₁-BSA、OTA-BSA、HT₂-OVA、α-ZAL-BSA、NIV-BSA?和FB₁-OVA；

6條檢測線距離樣品墊由遠及近的分布情況為：

（1）檢測線1：包被AFM1-BSA抗原的檢測線；

（2）檢測線2：包被OTA-BSA抗原的檢測線；

（3）檢測線3：包被HT2-OVA抗原的檢測線；

（4）檢測線4：包被α-ZAL-BSA抗原的檢測線；

（5）檢測線5：包被NIV-BSA抗原的檢測線；

（6）檢測線6：包被FB1-OVA抗原的檢測線。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測線上包被的抗原為六種霉菌毒素抗原分別與載體蛋白偶聯的抗原，所述載體蛋白為BSA、OVA或KLH；所述質控線噴涂有羊抗鼠二抗。

3.如權利要求1-2任一所述的試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維素膜的長度為4cm；所述硝酸纖維素膜上6條檢測線的間隔距離分別為3?mm。

4.如權利要求1-2任一所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑中，納米金-抗體復合物的OD₅₃₂均為2.5，按照單抗順序AFB₁：OTA：T-2：ZEA：DON：FB₁=2:1:2:4:2:3的比例混合。

5.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑中，納米金-抗體復合物的OD₅₃₂均為2.5，按照單抗順序AFB₁：OTA：T-2：ZEA：DON：FB₁=2:1:2:4:2:3的比例混合。

6.如權利要求1-2、5中任一所述的試劑盒，其特征在于，所述納米金的制備方法為：用超純水配制0.01％（m?/?v）氯金酸，取100?mL置于潔凈三角瓶中，加熱至沸騰，然后迅速加入1.0、1.6或2.5mL的1.0％檸檬酸三鈉（w?/?v）并不斷攪拌；反應20分鐘后，將溶液冷卻，加入超純水至初始體積，補充0.05％的疊氮化鈉；

所述納米金-抗體復合物通過以下方法制備得到：用0.1?M?K₂CO₃水溶液將10.0?mLOD_530nm?=?0.8納米金溶液調節pH值至7.0-8.5，不斷攪拌，然后分別加入1.0?mL?10-100?μg/mL的抗AFB₁、OTA、T2、ZEA、DON和FB₁的單克隆抗體；在室溫下孵育30分鐘后，加入含有2?mMpH8.5硼酸鹽緩沖液的1.0mL?的10%?BSA，并將溶液連續渦旋15分鐘；將混合物在5000?g下離心10分鐘，并將納米金-抗體復合物的沉淀物重新懸浮于10.0mL的2mM?pH8.5硼酸鹽緩沖液的0.10％BSA中；將離心和再懸浮步驟重復兩次，最后將沉淀重新懸浮于1％BSA、3％蔗糖和0.5％Tween-20中；將所有納米金-抗體復合物在532nm的光密度調節至2.5，然后將6個納米金-抗體復合物AFB₁：OTA：T-2：ZEA：DON：FB₁以2:1:2:4:2:3的比例混合，混合物以每孔200μL加入到微孔板中；將微孔中的溶液冷凍干燥，備用。