[發明專利]一種氧化葡糖桿菌及其在生產古龍酸中的應用

有效

• 申請號: 202011555961.0
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN112625955B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 司振軍;董菲菲;朱甲名;楊芝;俞柏金;陳召峰;黃國東;呂國鋒
• 申請（專利權）人: 浙江新和成股份有限公司;黑龍江新和成生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12P39/00;C12P19/02;C12P7/60;C12P17/04;C12R1/01;C12R1/11
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種氧化葡糖桿菌及其在生產古龍酸中的應用，屬于生物技術領域。本發明采用ARTP誘變，最終篩選得到一株溫度敏感型的氧化葡糖桿菌(G.oxydans)Nhu1209?1。該菌株的酶活與原始菌株相比，提高了10～15％，發酵周期縮短了8～10h。此外，該菌株在山梨糖發酵結束后，可以在較低溫度(45℃)和較短時間(20min)下實現徹底滅菌，不僅降低了能耗，同時也減少了對營養物質的破壞，有助于提高產酸量。

技術領域

本發明涉及一種氧化葡糖桿菌及其在生產古龍酸中的應用，屬于生物技術領域。

背景技術

維生素C(Vitamin C，簡稱VC)，即L-抗壞血酸(L-Ascorbic acid)，是人體必須從外界攝入的一種水溶性維生素，在醫藥、食品、化妝品、飼料等領域應用廣泛。2-酮基-L-古龍酸 (2-keto-L-gulonic acid，簡稱2-KGA)是合成維生素C的重要前體，目前“二步發酵法”依然是工業化生產VC的主要工藝。二步發酵法第一步是用氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) 將D-山梨醇轉化為L-山梨糖，然后用芽孢桿菌和普通生酮古龍酸菌混菌發酵，將山梨糖氧化為2-酮基-L-古龍酸，所獲得的2-酮基-L-古龍酸通過酯化反應等步驟合成維生素C。在此工藝中，第一步發酵制得的含有山梨糖的發酵液，需要在60～80℃下滅菌30分鐘以上，然后將滅菌后的發酵液作為二步發酵的培養基使用。這一過程能耗大，耗時長，對山梨糖的營養成分也有所破壞。

目前，也有為了降低能耗而不對發酵得到的含有山梨糖的發酵液滅菌，直接作為培養基使用，但第一步發酵中的氧化葡糖桿菌會隨著含有山梨糖的發酵液進入第二步的發酵過程，并在第二步的發酵過程中消耗培養基中的營養物質，使得底物轉化率顯著降低，僅有 60％～80％，且轉化率不穩定，與現有技術中滅菌的二步發酵法90％以上的轉化率相比，存在一定的差距。

發明內容

為解決上述含有山梨糖的發酵液滅菌過程中存在的能耗大，耗時長，對發酵液的營養成分有所破壞等問題，本發明篩選獲得了溫度敏感型氧化葡糖桿菌菌株，適用于山梨糖低溫滅菌過程。本發明的溫度敏感型氧化葡糖桿菌菌株，能夠在較低溫度下實現徹底滅活，帶來了以下優勢：1.降低了低溫滅菌過程中的能耗；2.降低了還原糖與有機氮高溫條件下的復雜的副反應，從而降低了山梨糖發酵液中營養成分的破壞。

本發明的第一個目的是提供一株氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)Nhu1209-1，已于2020年11月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO.21196。

在本發明的一種實施方式中，所述菌株氧化葡糖桿菌Nhu1209-1的誘變篩選方法是：將出發菌株氧化葡萄糖酸桿菌CGMCC No.17448，經ARTP誘變后，通過平板影印法最終篩選得到溫度敏感型的目標菌株氧化葡糖桿菌Nhu1209-1。其具體步驟為：

(1)出發菌株活化：將保藏于甘油管中的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)CGMCC No.17448于固體培養基上劃線，在25～37℃下培養10～20h，挑取單菌落于新鮮液體培養基，25～37℃培養8～24h后，按20～60mL/100mL接種量轉接新鮮液體培養基，進行同步培養；

(2)ARTP誘變處理：將步驟(1)得到的菌液用新鮮的液體培養基稀釋至OD₆₀₀為0.6～0.8 后，取5～15μL均勻涂于無菌載片上，在ARTP育種系統作用下開始誘變處理；

ARTP育種系統，所用氣源為氦氣，氣體流量設定為15～45SLM(StandardLiterperMinute，公升/分鐘)，功率為30～50W，處理時間為15-35s，照射距離為1～3mm。

(3)突變株的后培養：將誘變后的菌液均勻涂布于含有新鮮固體培養基的平板A上，30℃培養4～16h；