[發明專利]一種食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌快速檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202011553110.2
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN112481400A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 楊秀清;任帥偉
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

1.一種用于食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌快速檢測的引物組及DNA片段，其特征在于，所述引物組包括SEQ ID NO：1-6所示的引物；所述DNA片段包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的片段。

2.根據權利要求1所述的一種用于食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌快速檢測的引物組及DNA片段，其特征在于：所述引物組及DNA片段是通過化學合成的核苷酸片段。

3.一種權利要求1所述的用于食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌快速檢測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物組和DNA片段，PCR緩沖液，STE緩沖液。

4.根據權利要求3所述的一種用于食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌快速檢測的試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包括5μl 10×Easy Taq Buffer，4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，1.5μl基因組DNA，36.5μl ddH₂O。

5.根據權利要求3所述的一種用于食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌快速檢測的試劑盒，其特征在于：所述STE緩沖液是由0.584g的NaCl、0.12g的Tris和0.37g的EDTA溶解于100ml的雙重蒸餾水配制而成的。

6.一種權利要求1-5任一項所述的食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌快速檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，提取樣品微生物基因組總DNA；

步驟2，分別以超純水、化學合成的DNA片段及樣品總DNA為模板進行PCR擴增，超純水擴增產物作為陰性對照，DNA片段擴增產物作為待測樣品的標準；樣品PCR擴增產物作為DGGE檢測的待測樣品；

步驟3，對標準和待測樣品進行DGGE檢測；

步驟4，DGGE檢測完畢后，將含有DNA片段及待測樣品的凝膠放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分鐘，拍照進行分析對比，當待測樣品條帶與標準條帶相同并在DGGE凝膠上處于同一水平位置時，說明待測樣品為食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌感染的樣品；當待測樣品沒有條帶或條帶與標準條帶在DGGE凝膠上不處于同一水平位置時，說明測樣品沒有感染食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌。

7.根據權利要求6所述的一種食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌的快速檢測的方法，其特征在于，所述步驟1中樣品微生物基因組總DNA提取的步驟如下：

(1)將樣品用0.22μm濾膜進行抽濾，將帶有微生物的濾膜用STE緩沖液洗滌，再12000rpm離心1min；

(2)沉淀中加入STE緩沖液300μl、溶菌酶30μl，吹洗混勻，在37℃下恒溫水浴3.5h；

(3)繼續加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒溫水浴2.5h，完成后取出，冷卻至室溫，加入NaCl70μl；

(4)加入450μl DNA提取酚試劑，混勻，12000rpm離心10min，取上清液；

(5)加入等體積的體積比為25：24：1的苯酚-氯仿-異戊醇抽提，12000rpm離心10min，取上清液，重復一次；

(6)加入2倍體積的異丙醇使DNA沉淀，靜置后棄掉上清液，取沉淀；

(7)用75％乙醇溶液洗滌沉淀，吹洗，靜置2分鐘后吸出乙醇；

(8)加入40μl ddH₂O、2μl RNA酶，在55℃下水浴30min，放入4℃恒溫箱內保存過夜，待用。

8.根據權利要求6所述的一種用于食品病原菌致瀉大腸埃希氏菌的快速檢測的方法，其特征在于，所述步驟3中DEGG檢測為：選擇8％的聚丙烯酰胺凝膠，膠變性范圍為40％-60％，梯度混合制膠；電泳液溫度上升至55℃時，先220V恒壓預電泳5min，用50μL微量進樣器快速上樣，上樣量為30μl；在55℃，85V條件下恒溫恒壓電泳8h。