[發(fā)明專(zhuān)利]一種淋巴細(xì)胞及其培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011552820.3
• 申請(qǐng)日: 2020-12-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112608903A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王冶陶;彭昉;俞英豪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州中贏生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/10;C12N5/0783;A61K35/17;A61P31/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種淋巴細(xì)胞及其培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)體系包括滅活的基因工程細(xì)胞、IL?2、FBS、抗CD3抗體和淋巴細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；基因工程細(xì)胞為表達(dá)IL?21、IL?12、CD80和CD206的細(xì)胞。將該培養(yǎng)體系與單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，可以得到大量的免疫細(xì)胞，其中NK細(xì)胞為主要成分。這些免疫細(xì)胞不但可以高效殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可對(duì)CD206陽(yáng)性的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞進(jìn)行高效去除。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種淋巴細(xì)胞及其培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞，Natural Killer Cell)行使著連接獲得性免疫和固有免疫橋梁的作用。一方面，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染及創(chuàng)傷時(shí)，NK細(xì)胞以防御者的身份通過(guò)非肽-MHC的識(shí)別方式快速、廣泛、特異地識(shí)別抗原，及時(shí)地清除病原微生物、變異細(xì)胞，發(fā)揮固有免疫的作用。另一方面NK細(xì)胞被認(rèn)為也部分參與了適應(yīng)性免疫應(yīng)答，能夠影響αβT細(xì)胞和B細(xì)胞的效應(yīng)功能。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，NK細(xì)胞既可以通過(guò)活化性受體直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞并被活化，也可以被輔助細(xì)胞(單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞等)活化。這些輔助細(xì)胞通過(guò)其模式識(shí)別受體來(lái)應(yīng)答內(nèi)外環(huán)境的變化，再通過(guò)分泌多種可溶性因子或直接接觸的方式將信號(hào)傳導(dǎo)給NK細(xì)胞。在人類(lèi)，已經(jīng)證實(shí)存在的可溶性因子有IL12、IL-18、typeI IFN、TNF-α等；直接接觸的分子有GITRL/GITR、CD48/2B4、MICA、MICB、ULBP1-ULBP3/NKG2D、AICL/NKp80等。基于以上原理在體外擴(kuò)增活化的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出良好的殺傷活性，并應(yīng)用于腫瘤生物治療中。

目前制約NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用的主要障礙之一就是難以得到足夠數(shù)量的NK細(xì)胞。如何在體外實(shí)現(xiàn)NK細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增是目前NK細(xì)胞治療的關(guān)鍵問(wèn)題。外周血中NK細(xì)胞僅占很小的部分。而腫瘤病人的外周血中往往NK細(xì)胞的數(shù)量和活性有明顯的下降。不同人NK細(xì)胞的性質(zhì)有很大差異。尋找高效的個(gè)性化的NK細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增方法對(duì)NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用起著關(guān)鍵性作用。

近年，人工抗原提呈細(xì)胞(使用基因工程技術(shù)制作的滋養(yǎng)層細(xì)胞)越來(lái)越多的用于NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增。比如把膜結(jié)合IL15和4-1BBL導(dǎo)入K562細(xì)胞，這種方法得到的人工抗原提呈細(xì)胞可以將NK細(xì)胞在21天平均擴(kuò)增277倍。把MICA和4-1BBL導(dǎo)入K562細(xì)胞，并加以IL15刺激NK細(xì)胞可在21天平均擴(kuò)增550倍。把mIL21、4-1BBL、CD64、CD86、tCD19導(dǎo)入K562細(xì)胞，這種方法得到的人工抗原提呈細(xì)胞可以將NK細(xì)胞3周平均擴(kuò)增一萬(wàn)倍以上。

CN 103484429 A公開(kāi)了一種NK細(xì)胞的高效制備方法，即通過(guò)聯(lián)合細(xì)胞因子和飼養(yǎng)細(xì)胞的刺激作用，提高NK細(xì)胞的增殖速度和純度。該發(fā)明將NCR3LG1和m IL-15同時(shí)轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞，m IL-15可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活化和增殖，而NCR3LG1作為NK細(xì)胞表面主要的活化受體之一NKp30的配體，可以有效的刺激NK細(xì)胞活化，且兩者有協(xié)同作用。再加上游離添加的IL-2和IL-21等因子的刺激，可以在21天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，使PBMC細(xì)胞數(shù)量得到超過(guò)500倍的增殖，CD3-CD56+NK細(xì)胞的比例超過(guò)70％。

這些方法可以有效的擴(kuò)增NK細(xì)胞，而且NK細(xì)胞的純度也達(dá)到了非常高的水平。利用這些方法擴(kuò)增的免疫細(xì)胞在體外試驗(yàn)中可以有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，但是在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中得到的效果與體外試驗(yàn)還是有一些差距。原因之一就是因?yàn)樵隗w內(nèi)腫瘤微環(huán)境的存在。僅僅提高免疫細(xì)胞的數(shù)量和對(duì)腫瘤的殺傷力，是不足以達(dá)到體內(nèi)抗瘤的理想效果的。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種淋巴細(xì)胞及其培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法。本發(fā)明通過(guò)在滋養(yǎng)細(xì)胞上表達(dá)TAM細(xì)胞特異性標(biāo)志物，使體外擴(kuò)增的免疫細(xì)胞同時(shí)具有更強(qiáng)的去除TAM細(xì)胞的能力，為免疫細(xì)胞治療腫瘤提供新的可能性。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：