[發明專利]一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的方法及其檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202011551119.X
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112553337A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 段小紅;楊春燕;陳瑞芳;張亮;張騰龍;周啟明
• 申請（專利權）人: 杭州求臻醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 姚瓊斯

本發明屬于分子診斷技術領域，特別是涉及一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的方法及其檢測試劑盒，所述試劑盒包括引物探針預混液，所述預混液中包括：檢測ERBB2基因的上下游引物、檢測ERBB2基因的熒光探針、檢測人ATCB內參基因的上下游引物、檢測人ATCB內參基因的熒光探針；所述方法包括以下步驟：S1、提供被測者的檢測樣本，所述的檢測樣本為血漿樣本；S2、從S1中血漿樣本中，提取待測樣本的ctDNA；S3、使用數字PCR平臺對S2中提取樣本進行擴增反應；S4、對擴增結果進行分析與判讀；本發明提供的ERBB2基因擴增檢測方法，是基于微液滴數字PCR檢測系統，減少人為操作干擾，結果穩定，準確度高，數據擴增效果好，能夠更便捷的用于輔助診斷與臨床治療指導。

技術領域

本發明屬于分子診斷技術領域，特別是涉及一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的方法及其檢測試劑盒。

背景技術

酪氨酸激酶受體ERBB2(又名ERBB2/NEU)基因，編碼185kDa的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，是EGFR家族成員之一。ERBB2基因的擴增或過度表達會導致細胞過度增殖而形成腫瘤。研究顯示，大約25％～30％的浸潤性乳腺癌和80％的胃癌患者均有ERBB2基因擴增或蛋白過表達。

ERBB2擴增或許可用于預測機體對ERBB2靶向治療藥物的敏感度，這類藥物包括拉帕提尼、曲妥珠單抗、帕托珠單抗、T-DM1等。以最早使用也是最成功的曲妥珠單抗(赫賽汀)為例，臨床研究表明，赫賽汀可顯著延長ERBB2陽性乳腺癌患者的PFS(無進展生存期)和OS(總生存期)。赫賽汀聯合化療能將腫瘤的復發風險降低52％，將患者的死亡風險降低33％。此外，對于ERBB2表達陽性、無法手術切除的局部晚期、復發或轉移的胃癌患者，接受曲妥珠單抗聯合化療的治療效果顯著優于單純治療。因此，準確判斷ERBB2基因擴增狀態對乳腺癌、胃癌等患者的預后判斷及優化治療方案均具有重要作用。

現階段國內外一般采用免疫組織化學(IHC)法檢測ERBB2蛋白的表達水平，采用熒光原位雜交(FISH)法檢測ERBB2基因擴增水平。IHC具有成本低、技術簡單、便于操作等特點，常是臨床檢測的首選方法。但IHC容易受到組織影響、缺乏標準化，結果判斷存在主觀差異，造成不同實驗室之間的IHC檢測結果可能存在差異。FISH檢測具有較高的準確性、靈敏度和特異性，其結果在不同實驗室間一致性較高，是目前ERBB2檢測的金標準。但FISH存在價格昂貴、檢測周期長、患者收費高、檢測者專業知識和實驗室條件的限制，不利于廣泛應用。此外利用IHC/FISH方法無法對患者體內腫瘤細胞的ERBB2基因狀態進行實時、動態的監測，來了解患者病情發展及治療過程中ERBB2基因狀態的變化情況。因此急需一種高靈敏度、準確度、易于操作標準化、多樣化檢測等優勢檢測方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒及其文庫構建方法，減少人為操作干擾，結果穩定，準確度高，數據擴增效果好，能夠更便捷的用于輔助診斷與臨床治療指導。

為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，所述試劑盒包括引物探針預混液，所述預混液中包括：檢測ERBB2基因的上下游引物、檢測ERBB2基因的熒光探針、檢測人ATCB內參基因的上下游引物、檢測人ATCB內參基因的熒光探針；

所述檢測ERBB2基因的上下游引物、探針包括如下序列：

上游引物：5'-ACAACCAAGTGAGGCAGGTC-3'SEQ ID NO:1；

下游引物：5'-GTATTGTTCAGCGGGTCTCC-3'SEQ ID NO:2；

探針：5'-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-3'SEQ ID NO:3；

所述檢測ATCB內參基因的上下游引物、探針包括如下序列：