[發明專利]一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的方法及其檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202011551119.X
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112553337A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 段小紅;楊春燕;陳瑞芳;張亮;張騰龍;周啟明
• 申請（專利權）人: 杭州求臻醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 姚瓊斯

1.一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括引物探針預混液，所述預混液中包括：檢測ERBB2基因的上下游引物、檢測ERBB2基因的熒光探針、檢測人ATCB內參基因的上下游引物、檢測人ATCB內參基因的熒光探針；

所述檢測ERBB2基因的上下游引物、探針包括如下序列：

上游引物：5'-ACAACCAAGTGAGGCAGGTC-3'SEQ ID NO:1；

下游引物：5'-GTATTGTTCAGCGGGTCTCC-3'SEQ ID NO:2；

探針：5'-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-3'SEQ ID NO:3；

所述檢測ATCB內參基因的上下游引物、探針包括如下序列：

上游引物：5'-CGCCCTTTCTCACTGGTTC-3'SEQ ID NO:4；

下游引物：5'-TAGTACCTACACCCACAACAC-3'SEQ ID NO:5；

探針：5'-CTCTTCTGCCGTTTTCCGTAGG-3'SEQ ID NO:6。

2.根據權利要求1所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，其特征在于：所述檢測ERBB2基因和ACTB內參基因的上游引物和下游引物的工作濃度為900nM。

3.根據權利要求1所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述檢測ERBB2基因和ACTB內參基因的熒光探針的工作濃度為250nM。

4.根據權利要求1所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述ERBB2基因擴增區域的探針SEQ ID No.3和ATCB內參基因的探針SEQ ID NO.6均可獨立地于5'端結合熒光基團，于3'端結合淬滅基團。

5.根據權利要求1所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，其特征在于，MET基因擴增區域的所述探針SEQ ID No.3和ATCB內參基因的所述探針SEQ ID NO.6的3'端均可獨立地結合MGB修飾基團后再結合淬滅基團。

6.根據權利要求1所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述的ERBB2基因探針標記的熒光基團為FAM，淬滅基團為NFQ。

7.根據權利要求1所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述的ATCB內參基因探針標記的熒光基團為VIC；淬滅基團為NFQ。

8.一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的方法，使用所述試劑盒進行PCR檢測，其特征在于，包括以下步驟：

S1、提供被測者的檢測樣本，所述的檢測樣本為血漿樣本；

S2、從S1中血漿樣本中，提取待測樣本的ctDNA；

S3、使用數字PCR平臺對S2中提取樣本進行擴增反應；

S4、對擴增結果進行分析與判讀。

9.根據權利要求18所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的方法，其特征在于，所述步驟S2具體操作如下：本發明適用樣本類型為患者全血樣本，通過QIAampCirculating Nuleacid Kit試劑盒，提取cfDNA作為ddPCR檢測的模板。

10.根據權利要求8所述的一種基于數字PCR技術檢測ERBB2基因擴增的方法，其特征在于，所述S3中PCR對反應預混液進行如下擴增反應：95℃預變性10分鐘；94℃變性30秒，57℃退火/延伸1分鐘，共進行45個循環，10℃保持。