[發明專利]一種非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA標志物的制備方法

在審

• 申請號: 202011548772.0
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112626197A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 梁廷明;馬敏娟;顧怡寧;鄢盛龍;夏靜
• 申請（專利權）人: 南京師范大學常州創新發展研究院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;G16B25/00
• 代理公司: 蘇州國卓知識產權代理有限公司 32331
• 代理人: 張入文

1.一種非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA標志物的制備方法，其特征在于：它的操作步驟如下：

步驟(一)、從National Center for Biotechnology Information的Gene ExpressionOmnibus數據庫中篩選出3個符合條件的小鼠NASH相關模型的lncRNA測序數據集，并下載這些數據集；

步驟(二)、分別對步驟(一)中得到的3個lncRNA測序數據集進行差異lncRNA的表達分析，得到3組差異表達lncRNA；取3組差異表達lncRNA的交集，得到在小鼠NASH中差異表達的lncRNA；

步驟(三)、根據文獻資料，構建蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導的小鼠NASH模型，并記錄小鼠體重；小鼠NASH模型構建成功后，進行小鼠眼球取血并通過頸椎脫臼法處死小鼠，進行解剖取組織樣，一部分用甲醛固定，一部分放-80攝氏度冰箱保存待用；

步驟(四)、將步驟(三)中得到的血清進行甘油三脂和總膽固醇的檢測，得到小鼠NASH模型中的血清學指標，再次確認小鼠模型構建成功；

步驟(五)、將步驟(三)中得到的一部分用甲醛固定小鼠肝組織進行蘇木精伊紅染色和油紅染色，檢測NASH模型鼠肝臟中脂質積累情況；

步驟(六)、將步驟(三)中得到的一部分放-80攝氏度冰箱保存待用的小鼠肝組織分別提取總RNA；

步驟(七)、將步驟(六)中得到的小鼠肝組織總RNA進行反轉錄；

步驟(八)、以步驟(七)中得到的反轉錄產物為模板，檢測步驟(二)中得到小鼠NASH中差異表達的lncRNA；

步驟(九)、將步驟(八)中得到的lncRNA表達結果與步驟(二)中的表達結果進行比對，選取表達趨勢一致，且表達差異最明顯的3種lncRNA作為判斷非酒精性脂肪性肝炎的標志物。

2.根據權利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA標志物的制備方法，其特征在于：步驟(一)中所述的測序數據集，是從GEO數據庫中搜索的數據集，經過條件篩選得到，篩選條件為：NAFLD、lncRNA或NASH、lncRNA；每個數據集要包含正常組和處理組樣本；每個數據集處理后有一個數據矩陣，行名為lncRNA名稱，列名為樣本名稱。

3.根據權利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA標志物的制備方法，其特征在于：步驟(二)中分別對得到的3個lncRNA測序數據集分別進行差異lncRNA的表達分析，利用R語言中limma包進行差異lncRNA的表達數據分析，上述差異lncRNA表達分析的閾值條件均設置為：|log₂FC|1，且FDR0.05；FC為差異倍數，FDR為偽發現率；滿足閾值條件的基因為差異表達基因；分別得到3組差異表達的lncRNA。

4.根據權利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA標志物的制備方法，其特征在于：所述的步驟(二)中得到的小鼠NASH中都差異表達的lncRNA包括MALAT、NONMMUT018086、NONMMUT057558、NONMMUT047819、NONMMUT015697、NONMMUT061275、NONMMUT013553。

5.根據權利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA標志物的制備方法，其特征在于：步驟(三)中的小鼠NASH模型是利用MCD飲食誘導構建的，周期為2-3周，所用小鼠為6-8周的C57BL/6J小鼠；血樣是通過小鼠眼球取血獲得，分為兩份，一份用于檢測血樣中的甘油三脂TG、總膽固醇含量TC、天門冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶含量；另一份用于檢測血樣中的lncRNA。

6.根據權利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA標志物的制備方法，其特征在于：步驟(九)中所檢測lncRNA在NASH小鼠模型肝臟中的表達趨勢與步驟(二)中得到的在小鼠NASH中差異表達的lncRNA表達趨勢一致，分別是NONMMUT015697、NONMMUT061275和NONMMUT013553這三種lncRNA、MALAT1和Lnc-Snhg1作為檢測中的陽性對照。