[發(fā)明專利]一種基于基因組DNA標準品測定絕對端粒長度的PCR方法

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• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN114657234A
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白玉杰;張艷;張曉娟;孫海星;王建輝;林思妮;吳東穎
• 申請（專利權(quán)）人: 山東荊衛(wèi)生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6886
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一種基于基因組DNA標準品測定絕對端粒長度的PCR方法，具體來說包括：基因組DNA標準品的制備、基因組DNA樣本的制備、端粒和單拷貝基因36B4引物的設(shè)計和合成、絕對定量PCR、結(jié)果分析，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過選取編碼酸性核糖體磷酸蛋白PO的36B4基因為單拷貝基因，作為數(shù)據(jù)歸一化的參考；通過系列稀釋的基因組DNA模板驗證擴增效率；通過qPCR熔解曲線分析引物擴增的特異性；通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的特異性。本發(fā)明使用基因組DNA作為標準品，最大限度地保證了標準品與目標樣本擴增效率的一致性，具有準確、高效、低成本和高通量的優(yōu)點，為端粒長度測定提供了一個簡單實用的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于基因組DNA標準品測定絕對端粒長度的PCR方法，采用已知平均端粒長度為70kb的1301細胞基因組DNA作為標準品，設(shè)計并合成端粒和單拷貝基因36B4的特異性引物，通過絕對定量PCR，測定樣本的絕對端粒長度。

背景技術(shù)

端粒是真核細胞染色體末端的核蛋白結(jié)構(gòu)，在維持染色體復制和預防染色體融合中起著重要作用。端粒酶是一種端粒合成酶，但在成年個體中僅在生殖細胞、干細胞和一些體細胞中表達，大多數(shù)組織中缺乏或有非常小的端粒酶活性。由于染色體復制、氧化應(yīng)激和炎癥等因素，端粒會逐漸縮短。據(jù)估計，人白細胞端粒長度每年約減少20-40bp，當端粒達到臨界長度時，細胞激活DNA損傷檢查點，導致細胞衰老或凋亡。因此，端粒長度是端粒功能的一個重要參數(shù)，它決定著染色體的穩(wěn)定性和細胞的增殖能力。

大量研究表明，端粒縮短與衰老或壓力存在關(guān)系，端粒長度可反映各種疾病、環(huán)境因素對細胞的影響。目前觀點認為，端粒不僅可以作為衰老的生物標志物，也是多種疾病的危險因素，包括心血管疾病、糖尿病、肥胖、肝硬化和癌癥等。盡管許多研究報告了端粒長度與各種疾病甚至死亡率的關(guān)聯(lián)，但在許多情況下，所使用的端粒測量技術(shù)內(nèi)在的變異性，使得難以得出明確的結(jié)論。因此，一種優(yōu)異的端粒測量技術(shù)需要定義良好，具有較高的穩(wěn)定性和可復制性，能有效評估端粒特征并適用于大樣本研究，這在精密醫(yī)學研究中尤為重要。

已經(jīng)開發(fā)了多種端粒長度測量技術(shù)，每種方法都有各自的優(yōu)缺點。端粒末端限制性片段分析(TRF)使用Southern blotting或凝膠內(nèi)雜交技術(shù)，與端粒DNA特異性標記探針雜交，獲得細胞群體的平均端粒長度。TRF法雖然是端粒長度測量的金標準，但需要大量的DNA，并且對檢測短端粒不敏感。單鏈端粒長度分析(STELA)和端粒最短長度分析 (TeSLA)主要用于最短端粒長度分析，但是對技術(shù)要求高，勞動強度大，且不能測量最長端粒長度。而基于熒光原位雜交技術(shù)的Q-FISH和Flow-FISH雖然可以確定細胞的平均端粒長度和其他相關(guān)變量，能檢測到端粒長度的細微變化，但對樣本要求很高，需要新鮮的細胞。目前應(yīng)用最廣泛的qPCR法允許使用少量的DNA來測量端粒長度，但是相對定量PCR只能得到相對端粒長度，而絕對端粒長度PCR雖然可以得到絕對端粒長度，但是使用的是寡核苷酸標準品，分子量小，不穩(wěn)定，極易造成移液誤差和氣溶膠污染，最大的問題是寡核苷酸標準品與基因組DNA存在結(jié)構(gòu)上的顯著差異，兩者的擴增效率可能不同，影響結(jié)果的可靠性。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明為了解決絕對端粒長度PCR變異系數(shù)高、可靠性低的問題，提供了一種基于基因組DNA標準品測定絕對端粒長度的PCR方法，實現(xiàn)端粒長度的快速準確測量。

技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：采用已知平均端粒長度為70kb的1301細胞基因組DNA作為標準品，設(shè)計并合成端粒和單拷貝基因36B4的特異性引物，通過絕對定量PCR，測定樣本的絕對端粒長度。

上述方法具體包括如下步驟：

(1)基因組DNA標準品的制備：1301細胞復蘇體外擴增培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，采用高分子量基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，使用Nanodrop超微量分光光度計測量其純度，使用Qubit熒光計測量其濃度；