[發明專利]一種基于基因組DNA標準品測定絕對端粒長度的PCR方法

在審

• 申請號: 202011546663.5
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN114657234A
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 白玉杰;張艷;張曉娟;孫海星;王建輝;林思妮;吳東穎
• 申請（專利權）人: 山東荊衛生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6886
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于基因組DNA標準品測定絕對端粒長度的PCR方法，其特征在于：采用已知平均端粒長度為70kb的1301細胞基因組DNA作為標準品，設計并合成端粒和單拷貝基因36B4的特異性引物，通過絕對定量PCR，測定樣本的絕對端粒長度。

2.一種基于基因組DNA標準品測定絕對端粒長度的PCR方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

基因組DNA標準品的制備：1301細胞復蘇體外擴增培養至對數增殖期，采用高分子量基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，使用Nanodrop超微量分光光度計測量其純度，使用Qubit熒光計測量其濃度；

基因組DNA樣本的制備：取適量全血或細胞，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，使用Nanodrop超微量分光光度計測量其純度，使用Qubit熒光計測量其濃度；

端粒和單拷貝基因36B4引物的設計和合成：設計并合成端粒和單拷貝基因36B4的引物；

絕對定量PCR：PCR反應分為兩部分，第一部分為端粒qPCR反應，使用基因組DNA標準品和端粒引物，檢測基因組DNA樣本中的端粒總長度，第二部分為單拷貝基因36B4 qPCR反應，使用基因組DNA標準品和36B4引物，檢測基因組樣本中單拷貝基因的拷貝數，每次反應都包含標準曲線；

結果分析：使用儀器自帶軟件，以系列稀釋的標準品CT值對稀釋倍數，得到標準曲線，測定斜率和R²值，確定擴增效率；通過qPCR熔解曲線分析引物擴增的特異性；通過凝膠電泳分析PCR產物的特異性；通過基因組DNA樣本中端粒總長度及單拷貝基因拷貝數，計算平均絕對端粒長度。

3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，1301細胞為人急性T淋巴細胞白血病細胞，文獻報道采用絕對端粒長度PCR方法測定端粒長度為70kb。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3）中端粒和單拷貝基因36B4引物序列如下：

Tel-F CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT

Tel-R GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT

36B4-F CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC

36B4-R CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（4）中端粒qPCR反應體系及條件如下：2×PowerUp SYBR Green Master Mix（10μl），基因組DNA標準品（0.002~20ng）或基因組DNA樣本（1ng），Tel-F（300nM），Tel-R（800nM），Nuclease-free H₂O 補齊20μl；按50℃2min，95℃ 2min，95℃ 15S、60℃ 1min40個循環進行反應。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（4）中單拷貝基因36B4反應體系及條件如下：2×PowerUp SYBR Green Master Mix（10μl），基因組DNA標準品（0.002-20ng）或基因組DNA樣本（1ng），36B4-F（300nM），36B4-R（500nM），Nuclease-free H₂O 補齊20μl；按50℃2min，95℃ 2min，95℃ 15S、52℃ 15S、72℃ 1min40個循環進行反應。

7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，基因組DNA標準品的量為0.002~20ng，根據阿伏伽德羅常數Avogadro’s number=6.02×10²³，1301細胞系DNA分子量=3.16×10⁹×660g/mol，計算出標準品單倍體拷貝數為0.577~5.77×10³copies，端粒總長度為3.23×10²~3.23×10⁶kb，10倍梯度稀釋5個濃度，制作標準曲線。

8.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，步驟（5）中平均絕對端粒長度計算公式為端粒總長度/（單倍體拷貝數×46）。