[發明專利]一種GLP-1類似物的半重組制備方法

有效

• 申請號: 202011545059.0
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN112522294B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 賴紅星;祝捷;馬文柱;姚元鋒;夏玉平;李正;蔣婷
• 申請（專利權）人: 珠海冀百康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C12P21/06;C07K14/605;C07K1/16
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 王洋

本發明公開了一種GLP?1類似物的半重組制備方法。本發明通過將具有融合基因和順式助溶蛋白因子DsbA的大腸桿菌重組工程菌株進行發酵，經誘導表達得到融合蛋白，提取并純化融合蛋白，在特定的體外條件下定點化學修飾獲得經脂肪酸側鏈修飾的融合蛋白分子，最后經特異性酶切獲得利拉魯肽和索馬魯肽分子。所述的融合基因具有以下結構通式：f?l?a；其中，f為伴侶蛋白的編碼基因，l為連接肽的編碼基因，a為GLP?1類似物的編碼基因。本發明結合了重組表達和化學合成的技術優勢，具有發酵產量高、可溶性表達蛋白比例高、修飾正確率高、純化制備簡單等特點，適用于工業化放大生產利拉魯肽和索馬魯肽。

技術領域

本發明涉及DNA重組及化學法制備融合蛋白技術領域，具體涉及一種GLP-1類似物的半重組制備方法。

背景技術

人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是37個氨基酸殘基的胃腸激素，參與血液葡萄糖代謝、胃腸分泌和代謝及食物攝取的調節。GLP-1以葡萄糖依賴性方式刺激胰島素分泌，刺激胰島素生物合成，促進β細胞拯救，減少胰高血糖素分泌、胃排空和食物攝取，從而達到穩定的降糖效果，不易誘發低血糖。

由于GLP-1及其類似物在治療2型糖尿病的優良效果，使其近年來在糖尿病治療藥物市場中逐漸占據重要地位。人體內具有生物活性的GLP-1主要是GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)，天然的GLP-1容易被血漿酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)迅速水解失活，不具有臨床使用價值。因此，對GLP-1結構進行修飾，形成具有同樣藥理活性的GLP-1類似物，并掩蓋DPP-IV的結合位點，延長半衰期是該類藥物研發的主要課題。現今已有多個GLP-1類似物上市，如：利拉魯肽、艾塞那肽、阿必魯肽、杜拉魯肽等，該類藥物在未來10年內將會是抗糖尿病藥物的重要增長點。

利拉魯肽(Liraglutide)是一種每日皮下注射一次的酰胺化長效GLP-1類似物。利拉魯肽是將GLP-1(7-37)的Lys34替換成Arg，并且在Lys26連接一條16碳棕櫚脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))而得到的衍生物，與天然GLP-1有97％的同源性。注射利拉魯肽后，其側鏈上連接的16碳棕櫚脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))鏈可驅動利拉魯肽分子自聯形成穩定的七聚體，從而延緩吸收；并且還可以在體內通過非共價鍵作用與人體血清白蛋白連接形成生物大分子物質，達到有效延緩腎臟的清除、DPP-IV的代謝作用以及促進該藥從注射部位緩慢釋放等作用，它的血漿半衰期長達約13h。

索馬魯肽(semaglutide)是一種每周注射一次的長效GLP-1類似物。索馬魯肽是將GLP-1(7-37)的Lys34替換成Arg，第Ala8位替換為α-氨基異丁酸，并且在Lys26連接一條18碳脂肪二酸側鏈，而得到的衍生物，與天然GLP-1有94％的同源性。相比利拉魯肽，索馬魯肽增長的碳鏈對白蛋白的親和力增強5-6倍，與白蛋白結合，增大了分子量，避免快速被腎臟清除，并防止代謝性降解，延長了體內半衰期，其半衰期可長達一周。

目前對于GLP-1類似物的生產制備工藝上，可以分為化學與生物兩大途徑。只含有蛋白氨基酸(即天然氨基酸)的多肽，例如天然GLP-1，可以采用重組技術或通過化學合成法產生。然而，還含有非蛋白氨基酸的多肽，例如N端突出端的GLP-1類似物，目前無法通過重組表達技術以實用的方式制備，而一般是通過化學合成法制備。

當采用化學法合成GLP-1類似物、GLP-1的截短類似物和GLP-1的衍生物時，例如中國專利CN102875665B一種合成利拉魯肽的方法、CN103275208B利拉魯肽的制備方法等，以上化學合成方法需要用到大量的有機溶劑，對環境造成嚴重污染，并且化學合成副反應較多，產率低，所使用的氨基酸原料成本高，整體生產成本較高。