[發明專利]一種GLP-1類似物的半重組制備方法

有效

• 申請號: 202011545059.0
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN112522294B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 賴紅星;祝捷;馬文柱;姚元鋒;夏玉平;李正;蔣婷
• 申請（專利權）人: 珠海冀百康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C12P21/06;C07K14/605;C07K1/16
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 王洋

1.一種融合基因，其特征在于，所述的融合基因具有以下結構通式：f-l-a；其中，f為伴侶蛋白的編碼基因，l為連接肽的編碼基因，a為GLP-1類似物的編碼基因；所述的伴侶蛋白為不含有賴氨酸的酸性蛋白；所述的連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示；所述的GLP-1類似物選自GLP-1(7-37)、GLP-1(9-37)或GLP-1(11-37)多肽類似物；

所述的伴侶蛋白為TrxA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.根據權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列為SEQ IDNO:1，其編碼的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:5。

3.根據權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列為SEQ IDNO:2，其編碼的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:6。

4.根據權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列為SEQ IDNO:3，其編碼的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:7。

5.根據權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列為SEQ IDNO:4，其編碼的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:8。

6.一種GLP-1類似物的半重組制備方法，其特征在于，所述的半重組制備方法包括如下步驟：

S1.構建權利要求1-5任一項所述的融合基因并連接到表達載體上，將順式助溶蛋白因子DsbA表達單元連接到表達載體的下游，將表達載體轉化至大腸桿菌中，經篩選得到重組工程菌株；

S2.將步驟S1所得重組工程菌株進行發酵，經誘導表達得到融合蛋白，提取并純化融合蛋白溶液；

S3.將步驟S2所得融合蛋白溶液與DMF充分混合均勻，用二異丙基乙胺將融合蛋白溶液的pH調節至11-12，并加入一定量的脂肪酸鏈活化物進行修飾反應；

S4.待步驟S3反應完后加入賴氨酰內切酶進行酶切反應，反應結束后經HPLC純化、冷凍干燥獲得GLP-1類似物。

7.根據權利要求6所述的半重組制備方法，其特征在于，所述的脂肪酸鏈活化物為N-棕櫚酰基谷氨酸-γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯或17-{(S)-1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸叔丁酯。

8.根據權利要求6所述的半重組制備方法，其特征在于，所述的脂肪酸鏈活化物的用量為：1mol融合蛋白加入1.7-2.2mol脂肪酸鏈活化物。

9.根據權利要求6所述的半重組制備方法，其特征在于，所述的賴氨酰內切酶的用量為：1g融合蛋白加入1-2AU賴氨酰內切酶。