[發明專利]一種利用細菌非生長耦聯特性生產β-1,3-葡聚糖的方法

有效

• 申請號: 202011544624.1
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112646846B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 袁建國;吉武科;高先嶺
• 申請（專利權）人: 山東國力生物科技有限公司;山東元核生物工程有限公司
• 主分類號: C12P19/08
• 分類號: C12P19/08;C12R1/01
• 代理公司: 濟南日新專利代理事務所(普通合伙) 37224
• 代理人: 劉亞寧

本發明涉及微生物發酵技術領域，具體涉及一種利用細菌非生長耦聯特性生產β?1,3?葡聚糖的方法。所述方法包括以下步驟：將產β?1,3?葡聚糖菌株進行活化，制備種子培養液；將種子培養液接入發酵培養基中，進行發酵培養；發酵結束后，將60?80%的發酵液轉入轉化罐內；向剩余20?40%的發酵液中加入發酵培養基至初始發酵體積，再繼續進行二次發酵，如此循環5?6次；S4.向轉化罐內分次流加糖液，進行全細胞轉化。本發明方法通過高密度發酵培養和流加補糖全細胞轉化的方式，可以顯著提高β?1,3?葡聚糖產量，并縮短生產周期，降低生產成本，解決了現有發酵工藝的不足。

技術領域

本發明涉及微生物發酵技術領域，具體涉及一種利用細菌非生長耦聯特性生產β-1,3-葡聚糖的方法。

背景技術

β-1,3-葡聚糖是一類主鏈由β-1,3-糖苷鍵連接而成的多聚糖，是天然無害的高分子物質，通常因來源不同而含有不同比例和大小的β-1,2/β-1,4/β-1,6-連接的支鏈。

β-1,3-葡聚糖具有能增強免疫活力、抗腫瘤、抗氧化、抗細菌、抗病毒、抗真菌、降低膽固醇、降血脂等生物活性，是一種良好的生物效應調節劑。同時，還具有保濕、抗炎、抗衰老、去皺、去頭屑、退黃、加快修復、增加皮膚彈性等功效，廣泛應用在醫藥、食品、化妝品、動物飼料添加劑等多個領域。

目前，β-1,3-葡聚糖主要來源于酵母、食用真菌和植物(如香菇、燕麥、青稞)，受限于技術的復雜和成本的高昂，β-1,3-葡聚糖主要為低純度的粗產物，生產過程產生的副產物也較多，產量受原材料成本制約。利用微生物發酵生產β-1,3-葡聚糖，具有不受季節限制、原料來源穩定易得、過程無副產物產生、批次間質量穩定的優點。

可得然膠(Curdlan)是由根瘤菌屬的細菌合成，以β-1,3-D-糖苷鍵連接成的水不溶性葡聚糖，工業生產采用間歇式發酵來獲得，生產周期長，產量偏低，每個周期開始都需要進行發酵罐的空實消，蒸汽消耗量較大。

中國專利申請CN110241150Aβ-1，3-葡聚糖的放大發酵方法，包括以下步驟：第一步、制備菌種活化培養基，按照KH₂PO₄ 0.3-1.0g/L；CaCl₂ 0.3-1.0g/L，MgSO₄ 0.6-1.2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.6-1.2g/L，蔗糖3.0-8.0g/L，瓊脂12.0-18.0g/L的質量濃度稱取物質，重蒸水溶解定容，調pH 6.5-7.0，115℃滅菌30分鐘；第二步、菌種活化，將菌株劃線接種于第一步所得菌種活化培養基，25-30℃靜置恒溫培養2-3天；第三步、制備種子培養液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化鈉3.0-5.0g/L的質量濃度稱取各物質，重蒸水溶解定容，調培養液pH 7.0-7.8，115-121℃滅菌20-30分鐘；第四步、培養種子液，從菌種活化培養基上刮取活化菌種轉接到100mL液體種子培養液中，于28-32℃搖床中以150-300rpm的速度震蕩培養48-72h，至培養液OD600值在0.6-0.9之間，作為初級發酵培養的種子液備用；第五步、制備初級發酵培養液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化鈉3.0-5.0g/L的質量濃度稱取各物質，重蒸水溶解定容，調培養液pH 7.0-7.8，115-121℃滅菌20-30分鐘；第六步、培養放大發酵種子液，按照種子液∶初級發酵培養液(V/V)比1∶300-800的比例，將種子液接種到初級發酵培養液中，于發酵罐25-35℃，發酵1-2天，調pH 6.5-7.0，攪拌速率150-200rpm，通氣量0.4-0.5vvm，至發酵培養液OD600值大于0.9，作為放大發酵培養的種子液備用；第七步、制備放大發酵培養液，按照蔗糖120g/L的質量濃度稱取，重蒸水溶解定容，調培養液pH 7.0-7.8，通入蒸汽115℃滅菌30分鐘；第八步、放大發酵培養，按照初級發酵培養液∶放大發酵培養液(V/V)比1∶300-800的比例，將初級發酵液接種到放大發酵培養液中，于發酵罐25-35℃，發酵5-9天，其中發酵第1-2天需控制pH為7.0，誤差不超過±0.1，攪拌速率為150-200rpm，通氣量為0.4-0.5vvm；定時取樣檢測，待氮源耗盡時，調pH至5.5，誤差不超過±0.1，攪拌速率為400-600rpm，通氣量為0.7-0.8vvm，最終獲得β-1，3-葡聚糖粗品。該方法得β-1，3-葡聚糖粗品最高產量為49.7mg/mL。該方法步驟復雜且所得β-1，3-葡聚糖產量較低。